特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用.pdfVIP

特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用 摘 要 肿瘤是当前人类面临的一大医学疾病。近几十年来表观遗传学围绕基因异常表达引 起的肿瘤发生，获得了许多重要的突破，其中组蛋白翻译后修饰（PTM）是当前世界范围 ε 内研究的热点。组蛋白赖氨酸残基的第五位氨基（N ）常常发生不同类型的 PTM 包括乙 酰化、磷酸化、泛素化和甲基化等。其中，组蛋白赖氨酸的异常甲基化与肿瘤细胞的转 化、异常增殖有着密切的联系。组蛋白赖氨酸甲基化的修饰受到两类具有相反功能的酶 调节：组蛋白赖氨酸甲基转移酶（KMTs）和组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDMs）。近年来， KDMs 在不同肿瘤的发生发展过程中扮演着越来越重要的作用,如促进原癌基因的表达激 活，免疫系统失调， DNA 损伤修复等。因此找出有效的抑制剂是治疗 KDMs 表达异常的 癌症的关键所在。 迄今为止，几种不同的高通量筛选（HTS）方法已经被开发用于寻找KDMs 的抑制剂。 但是假阴性、假阳性和无法实时监测酶活性是这几种方法的主要弊端，所以迫切需要一 种更加优化的检测 KDMs 活性的方法。鉴于上述现有技术的不足，本研究针对 KDMs，利 用核磁共振技术开创了一套新颖而特异性的检测酶活性和筛选抑制剂的方法。首先在较 复杂的环境如细胞裂解液，可以高选择性、特异性地检测底物和产物的变化，并确定了 酶依赖的反应过程，随后根据时间依赖的底物和产物的变化以及产物的绝对定量，设计 出酶活性计算公式，即能够实时监测 KDMs 酶活性和底物、产物的量变过程，同时我们 也检测到 KDMs 抑制剂在该体系中具有明显的效果。最后我们利用天然小分子化合物库 进行筛选，借助该方法较少假阴性、假阳性、省时和高特异性的优势，筛查出抑制 KDMs 酶活性的小分子化合物，期待可以作为抗癌药物，最终为临床治疗上带来帮助。相较于 既往的方法学研究，该方法具有更高的特异性、安全性、实时性等优点，结合生物分子 学技术，可以较准确地定性及定量反应的分子。未来利用该技术也可以直接或间接地探 索肿瘤生物学的发生、发展以及更好地实现精准治疗。 关键词：肿瘤，表观遗传学，组蛋白赖氨酸去甲基化酶，核磁共振波谱，抑制剂 I 特异性测定赖氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制剂筛选中的应用 Abstract Tumor is a major medical problem that human currently faces. In recent decades, epigenetics has made hub of important breakthroughs around the etiology of tumors caused by abnormal expression of genes. Among them, histone post-translational modification (PTM) is the current hotspot in the world. The fifth amino group (Nε) of histone lysine residues often undergoes different types of PTM including acetylation, phosphorylation, ubiquitination and methylation. The abnormal methylation of histone lysine is closely related to the transformation and abnormal proliferation of tumor cells. The modification of histone lysine methylation is regulated by two types of antagonistic enzymes: histone lysine methyltransferases (KMTs) and histone