第八章+酶免疫技术.docx

教学目的要求： 掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或 抗原；熟练掌握固相载体。 熟练掌握酶免疫技术的分类 熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及 原理 li!掌握酶免疫测定的应用 li! 酶免疫技术 放射免疫技术 荧光免疫技术 药 MrMCMIU 第一节酶免疫技术的特点 基本原理 ?酶标抗体（抗原） 酶高效催化反 111 与抗原（抗体）的 转异畦反应 应的专一性 抗原抗体反应 的特异性 抗原抗体反应 的特异性 ?酶对底物的显色反 ?对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析 第一节酶免疫技术的特点 基本原理 ?酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 挣异Jl主反应 ?酶对底物的显色反 应 抗原酶标抗体底物?对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析 抗原 酶标抗体 底物 9 一、酶和酶作用底物 （一）标记酶的要求： 活性高，纯度高 作用专一性强 性质稳定，易与抗原或抗体偶联 测定方法简便易行、敏感、精确 酶和底物对人体无害 酶和底物价廉易得 （-）常用的酶 ■ 1、辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ,HRP ） 国内以辣根过氧化酶最为常用 11 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 纯度数（RZ）值与 酶活性无关，酶活 性单位（U）比RZ值 更为重要 辣根过氧化物酶（HRP） In 酶的纯度并不代表 酶的活力 酶的纯度并不代表 酶的活力 II*RZ值：403nm （辅基） 与275nm （主酶）0D值之 比 II* HRP催化的反应式为: HRP DH2+H2o2^ - f D+2H2O 。2为受氢体，HRP对受氢体的专一性彳艮高 供氢体D习惯上被称为底物，底物有多种 HRP常用底物 邻苯二胺OPD反应后显橙黄色,加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nmo不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺TMB反应后显蓝色,加酸终止 反应后变为 ，测定波长450nm ,稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 由財亏配物临包寰卷％ (alkaline phosphatase, AP) 是一种磷酸酯水解酶,ri从大肠杆菌提取 是一种磷酸酯水解酶, ri 从大肠杆菌提取 AP的 底物对-硝基苯磷酸 pNPP)nm AP的 底物 对-硝基苯磷酸 pNPP) nmo 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵 (三)8-半乳糖昔酶 (p-galactosidase, p-Gal) 源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。 Ip-Gal_ 倒底物 4 -甲基伞酮基- 卩?D半乳糖昔 (4MUG) 酶作用后，生成高强度荧 光物，用荧光计测量。」 酶标记抗体或抗原 酶结合物酶标记物酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 （一）酶标记抗体或抗原的制备 技术方法简单、产率高，重复性 标记方法要求标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 标记方法要求 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 酶标记物稳定，不易发生解离 制备方法 1.戊二醛交联法 适合各种酶蛋白的标记° 2.过碘酸钠氧化法 常用于HRP标记抗体或抗原 9 （-）酶标记物的纯化与鉴定 1.酶标记物的纯化 |1|￡!±|H标记完成后应除去反应溶液中的游高酶、游 离抗体（抗原）、酶聚合物及抗体（抗原）聚合物， 避免游离酶増加非特异显色以及游离抗体（抗原） 的竞争作用 |1|￡!±|H 常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铉沉淀法等。 2.酶标记物的鉴定 2.酶标记物的鉴定 IE± I ri （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体（抗原）具有 免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。 三、固相载体 ＞固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结 合到固相载体的表面 ＞固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法 (-)固相载体的要求 ?结合抗体或抗原的容量大 ?抗体或抗原牢固地固定在其表面 ?不影响免疫反应性 ?利于反应充分进行 ?固相方法简便易行，快速经济 2.微颗粒微颗粒是由 高分子单体聚合成的微 2.微颗粒微颗粒是由 高分子单体聚合成的微 球或颗粒。 (-)固相载体的种类 1.塑料制品由聚苯 乙烯、聚氯乙烯制成。 形状。主要有微量反应 板、小试管和小珠三种。 3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜(NC)、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。 写 it WD14 WD16 （三）包被与封闭 将抗原或抗体固相化结合在固相载