单克隆抗体与基因工程抗体的制备.docx

第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备 第一节杂交瘤技术的基本原理 —、杂交瘤 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 第二节单克隆抗体的制备 一、 单克隆抗体的产生 二、 单克隆抗体的纯化 三、 单克隆抗体的性质鉴定 牝单克隆抗体的特性 第三节基因工程抗体制备 、人源化抗体 二、 小分子抗体 三、 抗体融合蛋白 四、 双特异姓抗体 五、 噬菌体抗体库技术 第四节单克隆抗体的应用 一、 检验医学诊断试剂 二、 蛋白质鬲我纯 三、 小分子抗体的应用 四、 抗体融合蛋白的应用 五、 双特异抗体的应用 六、 抗旅库技术的应用和前景 思考题小结 第一节杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（PEG）:细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化 增殖的杂交瘤细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体 抗体种类： 第一代抗体多克隆抗体(polyclonal antibody) 第二代抗体单克隆抗体(monoclonal antibody) 第三代抗体基因工程抗体(genetic engineering antibody) B淋巴细胞:寿命短，分 泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞: 单克隆抗体 寿命长, 一，杂交瘤技术 : 脾细咆 柢杭的） 龙炙 检测孙阳性孔 州隆打附产牛细地 （一）小鼠骨髓瘤细胞 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同 朝畝IT 胃中。阳 硼畛蛔零（二） 免疫小鼠 细胞性抗原: (1-2) x 10,只，不加佐剂，2?3周重复一次 可溶性抗原: 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3?6 100?200微克抗原，融合前3天，加强免疫 淋巴细胞 淋巴细胞发育 淋巴细胞发育 B-celi d iff erent I ati o n: clas diversity a n I iq43r*i ind^penden-t o n Li g ein nep-c-n deni 浆细胞 抗原接种 Amibnay (|Lig 门”^?rumf -io3 10 is 1Q 10|： 103 H 與 Days 3 10,: 1師 Rns （三）细胞融合培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液 细胞融合剂： PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 ATPEG,其纯度与毒性有所不同 AT 培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存 于-801或液氮及干冰中 免疫脾细胞的制备： 1X 108的淋巴细胞 无菌手术 饲养细胞: 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞 的纯化 饲养细胞 融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1: 3)50% PEG lmin内加完; 2min内加10ml培养液 细胞融合 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1： 2 ~ 5 lml 50%的PEG （无菌，预温37C ）在1分钟内滴完，静置90秒, 时间一到，将事先准备的培养液一滴一滴加入，停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔 细胞数为（0. 5-1.5） x 105个。融合后7天，换用HT培养液 融合细胞的早期培养 10-20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆 （四）杂交瘤细胞的选择性培养 HGPRT酶与TK酶: 次黄噤吟磷酸核糖转化酶 胸腺奮咤核普激酶 应用液： 8-杂氮鸟喋吟 聚乙二醇 HAT培养基： H ( Hypoxanthine ):次黄喋吟 A (Aminopterin ):氨基喋吟；叶酸拮抗物, 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine):胸腺囑咬核苔；“核昔酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA HAT选择作用: 淋巴细胞：不能生长，5?7天死亡；DNA合成的 主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5?7天死亡；HGPRT缺 乏，DNA合成的替代途径受阻 骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞 SP2/O: HGPRT- , TK-;长命 脾细胞：HGPRT+, TK+;短命（7天） 杂交瘤细胞:HGPRT+, TK+;长命 杂交瘤细胞: 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT,将H合成为噤吟 碱并最终与T 一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力 二、阳性杂交瘤细胞