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基于网络药理学探讨川芎嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的保护机制 川芎嗪（tetramethylpyrazine）是从传统中草药川芎中分离得到的化合物，具有血管生成和血管保护作用以及抗炎、抗氧化等功能，临床上被长期用于治疗心脑血管疾病和炎症性疾病。近来发现川芎嗪可以改善AP引起的胰腺和肠道损伤，通过抑制NF-κB的活化，阻断炎症因子释放和增加细胞凋亡来减轻AP的严重程度，具有治疗AP的潜能，但确切机制尚未明确。本研究借助于网络药理学筛选出川芎嗪治疗急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis, ANP）的靶点，进行功能富集分析和通路富集分析，探讨川芎嗪治疗ANP的核心靶点及其潜在的分子机制，并进一步在ANP大鼠模型上进行初步验证，以期为川芎嗪的基础研究和临床应用提供新的思路。 材料与方法 一、川芎嗪作用靶点的获取 利用中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP），以“2,3,5,6-tetramethylpyrazine”为关键词检索川芎嗪的作用靶点，下载其mol2 格式并上传到PharmMapper网站。靶点种类设定为Human Protein Targets Only (v2010, 2241)。利用Uniprot数据库对获得的靶点进行筛选，物种限定为“homosapiens”。 二、ANP相关靶点的获取 通过人类疾病信息相关数据库CTD（Comparative Toxicogenomics Database）、DisGeNET、GeneCards（The Human Gene Database)、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man），以“pancreatitis, acute necrotizing”为检索词对ANP相关基因进行检索筛查并整合，剔除重复项，获得ANP相关的候选靶点。 三、川芎嗪和ANP交集靶点蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选 将川芎嗪的作用靶点与ANP的候选靶点上传至在线韦恩图，得到川芎嗪和ANP的交集基因。将交集基因导入STRING(Search Tool for Retrieval of Interaction Genes)数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用(proteinprotein interaction networks, PPI)网络，将构建的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件，应用Network Analyzer插件进一步分析、调整后作图，并利用cytoHubba插件筛选PPI的关键靶点。 四、功能富集分析 利用R语言（4.0.3）clusterProfiler包（3.16.1）进行基因本体（gene ontology, GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。参数选择pvalueCutoff=0.05，pAdjustMethod=“BH”，qvalueCutoff=0.05。GO功能富集分析包括3个不同的水平：生物学过程，细胞组成和分子功能，根据P值从小到大选择前10位。 五、川芎嗪与ANP关键靶点分子对接 将已知的关键靶点与川芎嗪进行分子对接，得到对接亲和力，反映其稳定性。从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank, PDB）下载核心蛋白分子结构，从TCMSP下载川芎嗪的结构，将蛋白和川芎嗪结构导入PyMol 2.5.2和Auto Dock Tools 1.5.6软件进行分子对接及可视化处理。 六、实验动物及分组 30只250～350 g相同遗传背景的SPF级雄性SD大鼠均购自上海斯拉克公司，动物合格证号为SCXK（沪）20170005，按照数字表法随机分为对照组、ANP组和川芎嗪治疗组（川芎嗪组），每组10只。采用胰胆管逆行注射4%牛磺胆酸钠1 ml/kg的方法建立ANP大鼠模型。川芎嗪组在制模后5 min内经腹腔注射川芎嗪注射液10 ml/kg。注射用盐酸川芎嗪购自平光制药股份有限公司，溶于100 ml 0.9%生理盐水，药物浓度为0.6%。对照组仅经尾静脉注射等容积PBS。 七、胰腺组织病理学检查及关键靶点蛋白表达检测 大鼠于制模后12 h处死，取胰腺组织，常规固定，石蜡包埋，切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察胰腺组织的病理学改变。应用免疫组织化学染色检测胰腺组织表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase 3, CAS