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甘蔗自育品种ssr核心引物的筛选 我国甘蔗品种的繁殖始于20世纪50年代。在“15”期间，我们种植了近200种甘蔗新品种。其中，在“5”和“15”之间，发展最快的是通过省级以上审定的50个品种。 1 材料和方法 1.1 核心引物组合效率测定 27份甘蔗良种 (表1) 中19个品种通过国家、省级审定, 8个品种进入国家或云南省甘蔗品种区试, 有希望在“十一五”期间通过省级以上审定。同时选取10个中国蔗区主栽品种 (不包括云南甘蔗自育品种) 来检验核心引物组合效率。所有品种叶片组织由国家甘蔗种质资源开远圃 (National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources, NNSGR) 和云南省农科院甘蔗研究所 (Yunnan Sugarcane Research Institute, YSRI) 提供。 1.2 叶片矩阵dna提取与ssr分析 参照蔡青等 1.3 ssr-pcr扩增多态性条带比率及聚类区分率 采用人工读带的方式, 每对SSR引物检测1个位点, 在相同迁移位置上, 有带记为1, 无带记为0, 每条带相当1个等位基因建立0-1矩阵。使用标记位点的多态性条带比率 (percentage of polymorphic bands, PPB) , Jaccard (1908) 遗传相似性 (genetic similarity, GS) 、多态信息量 (polymorphism information content, PIC) 、品种聚类区分率 (rate of distinguishing cultivars by cluster, RDCC) 鉴别引物, 其中PPB=a/ (a+b) , Gs 1.4 dna分子量标准曲线图的绘制 根据分子量Marker的片段大小的对数值与电泳迁移距离绘制出DNA分子量标准曲线图, 然后用直尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移距离, 依据DNA分子量标准曲线图计算出每个片段的分子量, 同时根据0-1矩阵绘制胶板图的标准化图。 2 结果与分析 2.1 高引用效率分析 选择合适的引物是开展DNA指纹图谱研究的关键因素之一 2.2 最佳引物组合 虽然部分单对核心引物能够完全区分所有云南甘蔗自育品种, 但品种最大相似性系数达到了0.833, 随着以后自育品种数量的增多, 单个引物的区分效率将会明显下降, 因此有必要使用多对引物进行鉴定。为了选出有效的引物组合, 将8对引物进行两两组合, 从表4可以看出, 28个组合中26个组合可以将品种完全区分开, 引物组合MSSCIR26/SMC336BS, SMC21SA/MSSCIR66品种最大相似性系数为1.000, 品种聚类区分率为93%, 有两个品种无法区分, 因此属于低效的引物组合;而引物组合MSSCIR36/MSSCIR21是最有效的, 品种最大相似性系数为0.773, 最低, 品种聚类区分率为100%;其次为MSSCIR16/MSSCIR36, 第3为MSSCIR36/SMC336BS。整体来看引物MSSCIR36是比较有效的组合引物, 与其他引物组合具有很好的品种区分效果, 其次为MSSCIR21、SMC336BS、MSSCIR16。由于仅用两对引物就可以将所有参试品种有效区分, 故选用双引物组合产生的分子数据用于云南自育品种的DNA指纹身份证构建。 2.3 品种聚类关系 为了增加所构建分子指纹身份证的实用性, 选取中国蔗区种植面积较大的10个主栽品种 (不包括云南甘蔗自育品种) 与27份云南甘蔗自育品种进行相似性和聚类分析, 来检验排名前3的引物组合效率 (表5) 。评价结果表明, 3个引物组合对37份品种的聚类区分率都为100%, 都能有效地区分所有参试品种。从37份品种最大相似性系数来看, 引物组合MSSCIR36/MSSCIR21的最大, 为0.882, 品种聚类关系表现为云蔗71-998与桂11最为相似, 为0.882, 其次为云蔗65-225与云蔗68-154, 为0.773;引物组合MSSCIR16/MSSCIR36、MSSCIR36/SMC336的品种最大相似性系数都为0.800, 从表面来看两个引物组合效率相当, 但从不同引物组合得到的品种聚类关系来看MSSCIR16/MSSCIR36的综合区分效率最好, 可作为构建云南甘蔗自育品种分子指纹身份证的最佳引物组合, 因为MSSCIR16/MSSCIR36表现出的品种聚类关系中以主栽品种之间最为相似, 如桂17与粤糖93-159最为相似, 为0.800, 其次为ROC22与ROC10为0.789, 第3为云蔗71-95与云蔗03-103, 为0.778, 与主栽品种最为相似的云南甘蔗自育品种为云蔗99-596, 为0.667, 所以在保证能有