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白纹伊蚊gm与gua株的诱导胞质不相容程度评估 近年来，随着世界的变迁、交通便利、环境恶化，适应虫生存环境的地理环境不断扩张，各种害虫手段的大规模爆发。蚊媒病对全球的经济发展和人类正常生活都造成重大影响。然而大多数病毒性虫媒病并无特效药物和有效地疫苗可以应用 1 材料和方法 1.1 wolbachia为基础的微生物蚊、gua株、gs株的筛选,其五环素去除gua的重组株,wp、gm、gs株的建立,其也可以在wolbachia、gm株感染的wp型白纹伊蚊gs、gt株、wp型白纹伊蚊gs、双环素蚊、pbp型白纹伊蚊gs、pbp型白纹伊蚊gs、pga、pga、gm株感染gua株、wolbachia等多环素蚊、pbp型白纹伊蚊、pbp型白纹伊蚊、gs株wp型 实验所涉及的蚊株包括:自然感染w Alb A和w Alb B的广州本地白纹伊蚊(GUA株)、四环素去除GUA株Wolbachia感染的白纹伊蚊(GT株)、单感染w Pip的白纹伊蚊(GM株)。GM株的建立是将骚扰库蚊携带的w Pip型沃尔巴克氏体通过胚胎显微注射技术转染至GT株。蚊株均由中山大学-密歇根州立大学热带病虫媒控制联合研究中心提供。 1.2 pcr检测仪器 DNAiso Reagent(Takara),动匀浆器(Kontes,美国)、电泳仪(DYY-6C,北京)、梯度PCR扩增仪(Bio Metra,德国)、凝胶成像系统(Tanon,上海)、Milli-Q型纯水仪(Millipore,美国)。 1.4 蚊株的孵化和生殖时间 将三种蚊株的蚊卵各200颗(蚊卵小于7 d),分别放置于蚊虫饲养盒中,加300 ml去氯的自来水以浸泡蚊卵,并加0.5 mg酵母粉以诱导幼虫产出。待24 h后,将幼虫计数。每天分别于10:00 am、16:00 pm和22:00 pm观察并计算成蛹数目。将每个时间点的蚊蛹转移直径为2 cm、长度为20 cm的圆柱塑料管中,每条塑料管所加蚊蛹数目不大于10个。塑料管底部浸入水中,顶部加透气胶塞以防止蚊蛹羽化飞出。同样每天分别于10:00 am、16:00 pm和22:00 pm记录羽化成蚊数目,并判定成蚊性别。记录蚊虫的成蛹时间以及羽化时间,即一龄幼虫--蛹和一龄幼虫--成蚊的时间。计算蚊虫的孵化率、成蛹率、羽化率和雌雄比例,进行三种蚊株之间的两两比较。实验重复3次,取3次平均值±标准差。 1.5 gm株诱导ci试验 GM株能否与自然蚊株交配产生单向或双向CI现象是其能否应用于野外释放的决定性因素,因此本实验设计不同的杂交组合来评估GM株的CI程度。将GM、GT以及GUA三种蚊株进行不同组合的杂交,观察不同组合之间的蚊卵孵化率,通过蚊卵孵化率评价GM株的CI程度。实验设置四组杂交组合,分别为实验组:GUA♀×GM♂,GM♀×GUA♂,GT♀×GM♂,GM♀×GT♂;对照组:GUA♀×GUA♂,GM♀×GM♂,GT♀×GT♂(♀:代表成蚊雌性,♂:代表成蚊雄性)。具体方法为:各取20只刚羽化的雄蚊、雌蚊,置于15 cm×15 cm×15 cm的蚊笼内,正常饲养。随机交配5 d后,血餐,2 d后放置产卵杯,雌蚊产卵4~5 d,计算产卵量。将所产蚊卵放入装有清水及酵母粉的孵育盒中,待蚊卵孵化后(至少7 d),计算幼虫孵化数,七组交配组合蚊卵孵化率进行两两比较,评估GM株诱导CI的程度。实验重复3次,取3次平均值±标准差。 1.6 pcr检测蚊株wolbachia类别 随机抽取三种蚊株雌雄蚊各20只,按照DNAiso Reagent(Takara)试剂说明书提取DNA,通过PCR技术对三种蚊株的Wolbachia类别进行鉴别。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离(150 V,20 min),引物序列参照文献见表1。 1.7 正态性检验ls 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验符合正态分布或近似正态分布,以(ue0af±s)描述;多重比较方差齐时采用ANOVA-Bonferroni法,P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 pcr检测蚊株携带wolbachia类型及感染率 为确定三种蚊株是否真实携带相对应的Wolbachia,因此通过提取实验蚊株的DNA,PCR检测蚊株感染Wolbachia类型及相应感染率。实验结果表明,GUA株携带w Alb A、w Alb B两种类型,感染率100%;GM株单感染w Pip,感染率100%;GT株未携带任何Wolbachia,见表2。 2.2 对蚊蛹、成蚊的存活率 蚊卵孵化率、存活率、雄蚊比例、生长周期均进行三种蚊株两两比较。与GT株和GM株比较,GUA株的蚊卵孵化率明显升高,差异有统计学意义(P0.05),而GM株和GT株差异无统计学意义(P0.05)。蚊蛹、成蚊的存活率,三种蚊株均差异