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胎仔骨骼畸形检查方法的改进 通过胎盘骨骼的畸形检查，评估化学品是否具有发育毒性。而刚出生的胎仔骨骼只有部分被骨化,另一部分骨骼仅以软骨的形式存在。传统的毒理学骨骼畸形检查方法只能使硬骨组织着色,因此仅能检查硬骨组织畸形的变化,而不能观察出软骨组织是否有畸变 1 材料和方法 1.1 样品溶液的制备 主要试剂:阿利新兰8GS为Chroma进口分装;茜素红S购于沈阳市试剂三厂;苯甲醇、丙酮、乙醇均为国产分析纯。软骨染色液:阿利新兰9 mg,用60 ml无水乙醇溶解,再加40 ml冰醋酸,充分混匀。 骨染色液:在100 ml 0.5%氢氧化钾溶液中加入1 ml 0.1%茜素红,充分混匀。复合骨骼染色液:0.3%阿利新兰溶液(70%乙醇作为溶剂)15 ml,0.1%茜素红(95%乙醇作为溶剂)15 ml,醋酸15 ml,70%乙醇255 ml。以上溶液充分混匀。实验动物:25~30 g昆明种小鼠,由吉林省长春市高新医学动物实验研究中心提供,许可证号:SCXK2(吉)2003-2004。 1.2 方法 1.2.1 妊娠动物的剖腹观察 按雌雄比例为2∶1选取性成熟健康未交配过的昆明种小鼠,在同一实验室分笼观察饲养1周后,将雌雄按2∶1比例于下午5时置同笼交配,次日早检查阴栓,发现阴栓的当天将已交配过的孕鼠取出,称重,并记为孕期0 d,于分娩第18天用颈椎脱臼法处死妊娠动物,立即剖腹,暴露卵巢和子宫,取出胎仔。 1.2.2 骨的复染复染 将胎仔固定在10%福尔马林溶液中2 d以上,剥去胎仔皮肤,去除内脏,流水冲洗12 h,再用蒸馏水冲洗5~6次。将胎仔置于软骨染色液中染色24~48 h。再将胎仔转移至无水乙醇中脱水3~4 d。将脱水后的胎仔移入骨染色液中,进行骨的复染。将胎仔逐步转移到25%、50%、75%和100%甘油水溶液中,进行软部组织脱色,脱色后即可检查畸形情况 1.2.3 复合骨髓染色 将胎仔置于95%乙醇中固定4 d以上,剥去皮肤,去除内脏。浸入丙酮溶液中1 d以上进行脱脂。将胎仔移入复合骨骼染色液中,在37℃条件下,染色2~3 d。流水冲洗12 h,再用蒸馏水冲洗5~6次。用1%氢氧化钾溶液浸泡12~48 h至胎仔呈透明。将胎仔在含1%KOH的20%甘油水溶液中,浸泡1~5 d,进行软部组织脱色。胎仔逐步移入到50%、75%和100%的甘油水溶液中,进行脱水,脱水后即可观察 2 结果 2.1 材料的染色效果 染色后的标本置于试管中,由图1A、1B可见,采用二步法染色,获得的标本着色效果良好,肌肉组织呈完全透明,骨和软骨清晰可见。硬骨组织呈红色,软骨组织呈蓝色。在体视镜下可清楚地观察到标本的骨骼发育形态。但标本的质地较柔软,在取用时要特别注意防止损伤。(如需彩图,可与本刊编辑部联系) 2.2 肌肉组织的观察 由图1C和1D可见,采用一步法染色的胎仔标本,硬骨组织也呈红色,软骨组织呈蓝色。虽然获得的标本骨组织也能很好的着色,轮廓清晰。但由于肌肉组织呈半透明浅黄色,对于里面的骨骼具有一定程度的遮盖。所以对于细小的硬骨(如指骨)及软骨不容易观察。但获得的胚胎质地较硬,取用观察时不易破碎。 3 小鼠胎仔的染色 目前,对于骨骼畸形的检查主要以传统的茜素红单染为主。该法只能使已经骨化的骨骼红色,而未骨化的部分却不显色。所以只能观察到胎仔硬骨组织的畸形情况,对于骨骼的发育状况检查不全面 本研究中,标本的固定方法也有一定的区别,一是采用10%福尔马林溶液固定,另一是采用95%乙醇固定。在研究中发现,两种方法都能起到很好的固定作用,获得的标本都较易进行后续的剥皮工作。此外,在配制染色液及固定液时,液体的体积不可过少,否则置入胎仔后可能造成固定液及染色液浓度的改变,试验中发现平均每只小鼠胎仔要达到10 ml方可实现理想的染色效果。在进行二步法染色脱水时,要注意每天更换无水乙醇使骨脱色完全,否则在进行骨复染时会有阿利新兰扩散的可能。若一个瓶内放置多个胎仔,在进行脱水及染色时要注意每半天轻轻摇匀,避免胎仔彼此过于紧密造成染色不均。另外,采用二重法染色时,胎仔必须剥皮,去净颈、背和两肩脚处的脂肪,否则因阿利新兰不易透过脂肪组织,软骨很难着色。有很多学者认为,标本在进行染色前一定要经过丙酮脱脂