酚氧化酶原系统在甲壳动物中的应用.docxVIP

酚氧化酶原系统在甲壳动物中的应用 克氏原始繁殖虾，也被称为克氏共裂虾，属于节肢动物门、甲壳纲、软甲壳、足部科。它来自美国，1918年从美国引进日本，1929年从日本引入中国江苏省南京附近。 酚氧化酶是一种含铜的酶, 能够催化单酚羟化成二酚, 并把二酚氧化成醌, 醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验用虾及其清洗 试验用虾, 雌、雄各10只, 体重30~40 g, 系购于安徽省合肥市杏花菜市场健康虾。实验前在水族箱中暂养1周, 使其适应水族箱养殖环境。水族箱在试验前用1%新洁尔灭浸泡清洗。饲养期间, 保持水族箱内水温在20~25℃, p H7.0~7.4, 每日晚间按每只虾0.5 g饲喂1次全价颗粒料。 1.1.2 sybr试剂 提取总RNA的试剂为Invitrogen公司产品, Real time-PCR采用Ta Ka Ra公司SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) 试剂, p GEM-T Easy Vector、Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit、逆转录酶及其他主要试剂为Promega公司产品。PCR的扩增引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。 1.1.3 高速冷冻离心器 荧光定量PCR仪、PCR仪为美国Bio-rad公司产品;高速冷冻离心机、高速离心机为德国Eppendorf公司产品;其他仪器为购自商业公司的实验室常规仪器。 1.2 方法 1.2.1 propof和propor引物的设计及扩增 应用生物学软件Primer Primirer 5.0和DNAStar 5.01, 根据Gen Bank上登录的克氏原螯虾酚氧化酶原序列 (登录号:EF595973) 的保守区域设计引物pro POF和pro POR, 并用此对引物扩增pro PO基因c DNA部分片段 (见表1) 。引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。 1.2.2 总rna的纯化 样品采集:分别无菌采集雌虾的血淋巴、肠、肝胰腺、肌肉、卵巢、皮肤、腮、胃及雄虾的血淋巴、肠、肝胰腺、肌肉、精巢、皮肤、腮、胃等组织作为提取总RNA的组织样品。 利用Trizol试剂按如下步骤提取总RNA:用一次性注射器预先抽取适量的抗凝剂, 围心腔抽血约2 m L置入5 m L Ep管, 其中全血体积约1 m L;4℃, 5 000 r·min 其他组织按以下方法处理:取组织约500 mg, 加5 m L Trizol, 无菌条件下经组织匀浆器充分研磨, 取混匀的组织匀浆液1 000μL于1.5 m L Ep管中, 剧烈摇动, 室温静置5 min;后续进程同总RNA提取对应步骤。 总RNA的完整度和纯度通过甲醛变性的琼脂糖凝胶进行电泳检测。具体方法为:称取0.5 g琼脂糖粉末, 加入放有36.5 m L DEPC水的锥形瓶中, 加热使琼脂糖完全溶解;稍冷却后加入5 m L的10×电泳缓冲液、8.5 m L 37%的甲醛;然后在胶槽中灌制凝胶, 插好梳子, 水平放置待凝固后使用;同时在一个洁净的离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液 (10×) 2μL、37%甲醛3.5 m L、甲酰胺10 m L、RNA样品3.5μL, 混匀, 置60℃保温10 min, 冰上速冷;加入3μL的上样缓冲液混匀, 取适量加样于凝胶点样孔内;稳压7.5 V·cm 1.2.3 pcr法 总RNA提取后, 经检测合格, 即进行c DNA第一链的合成, 取一灭菌的PCR管, 加入RNA 3μL, Oligod T-anchor 1μL, DEPC水8μL, 置PCR仪中70℃, 5 min;立即冰浴;加入5×RT Enzyme Buffer 4μL, d NTP (10 mmol·L 1.2.4 pcr扩增及重组质粒的构建 以4μL的c DNA作模板, 采用引物pro POF和pro POR进行PCR扩增。PCR反应条件为:50μL反应体系中含有10×反应缓冲液5μL、d NTP (10 mmol·L 将扩增获得的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物, 克隆于p GEM-T Easy载体, 转化DH5а大肠杆菌, 摇菌提取质粒, 重组质粒经PCR和酶切鉴定后, 交上海Invitrogen生物有限公司测序。 1.2.5 标准光束成像曲线的制定 测定测序鉴定为阳性重组质粒的A 1.2.6 荧光定量pcr法检测不同组织中酚氧化酶原mrna表达 按前述稍加改进的总RNA提取方法, 分别提取试验用健康克氏原螯虾不同组织, 包括肠、肝胰腺、肌肉、卵巢、精巢、皮肤、腮、胃、血淋巴的RNA, 按照前述反转录的方法分别合成c DNA进行实时荧光定量PCR