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活性污泥脱氢酶活性检测方法的比较与优化 采用分光光度法测定脱氢酶活性（突变）时使用的主要氢个体主要是氯仿三甲基四羧紫（ttc）、碘硝基四氮唑兰（int）和亚甲基蓝。 1 材料和方法 1.1 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌培养物 (37℃振荡培养18 h左右, 离心后用生理盐水制成一定浓度的菌悬液) ;好氧污泥 (均取自污水厂二期好氧中段) , 厌氧污泥 (均取自ABR第二格中层) 。 1.2 氯化三苯基四氮唑tt-ldb Tris-HCl缓冲液 (0.05 mol/L, p H=8.4) :称取6.057 g三羟甲基氨基甲烷加入20 m L 1.0 mol/L的HCl, 再定容至1 L。 TTC溶液 (0.4%) :称取1 g氯化三苯基四氮唑, 溶于蒸馏水中, 用250 m L定容瓶定容。 INT溶液 (0.2%) :称取200 mg碘硝基四氮唑紫, 加热溶于蒸馏水中, 用100 m L棕色容量瓶定容。 抗坏血酸 (0.7%) :使用前临时配制。 1.3 ttc-脱氢酶活性测定 具体参照《环境工程微生物检验手册》 1.4 脱氢酶活性测定 1.4.1 trs-hcl-pcr反应 配制浓度分别为50 mg/L (0.099μmol/m L) 、100 mg/L (0.198μmol/m L) 、200 mg/L (0.395μmol/m L) 、400 mg/L (0.791μmol/m L) 、800 mg/L (1.582μmol/m L) 的INT溶液。取6支10 m L离心管, 按浓度从低到高的顺序, 分别加入INT溶液0.3m L, 其中第6支离心管为空白 (加0.3 m L纯水) , 每支离心管中各加入Tris-HCl缓冲液1.5 m L、0.7%抗坏血酸溶液0.2 m L。混匀后置于37℃恒温水浴培养箱中, 暗处振荡培养30 min, 加入37%甲醛1m L终止反应;5 000 r/min离心5 min轻轻弃去上清液后, 加入5 m L甲醇, 混合搅拌均匀, 继续在37℃下暗处振荡萃取10 min, 5 000 r/min再离心5 min, 取上清液在485 nm处测定吸光度A, 由此得到INT-A标准曲线。 1.4.2 样品处理和酶反应 向10 m L离心管中依次加入活性污泥混合液0.3 m L、Tris-HCl缓冲液1.5 m L、0.2%INT溶液1m L (空白管加入1 m L纯水) 。迅速将制备完成的样品放入37℃水浴锅中振荡培养30 min, 加入37%甲醛1 m L终止酶反应;5 000 r/min离心5 min轻轻弃去上清液, 加入5 m L甲醇, 混合搅拌均匀, 继续在37℃下暗处振荡萃取10 min, 4 000 r/min再离心5min, 取上清液在485 nm处测定吸光度, 查标准曲线计算脱氢酶活性值。 2 结果与讨论 2.1 培养方法对脱氢酶活性的测定值的影响 2.1.1 脱氢酶活性的测定 将枯草芽孢杆菌菌悬液按梯度浓缩后, 代替活性污泥进行脱氢酶活性的测定。除培养时分别采用开盖振荡培养 (氧气充足) 和密闭静置 (模拟缺氧条件) 培养外, 其余试剂的加量和处理方法均参照常规方法, 试验结果见表1。 2.1.2 培养条件对鉴定结果的影响 分别采用不同品种的活性污泥, 包括枯草芽孢杆菌培养物、厌氧泥、好氧泥, 同一样品在不同培养条件下进行DHA的测定, 结果见表2。 试验结果表明, 采用TTC法时, 培养条件对检测结果影响显著, 总体看来, 密闭静置培养的测定结果明显高于开盖振荡培养结果, 而不同培养方式对INT法的测定结果基本没有影响。该现象可能与TTC、INT两种物质具有不同的氧化还原电位有关, 氧化还原电位越低与电子的亲和力越强, 与氧竞争电子的能力越强, 还原反应时氧的干扰作用越小。TTC的氧化还原电位较高 (+490 m V) , INT的氧化还原电位较低 (+90 m V) , 使得在用TTC检测污泥脱氢酶活性时, 如果不采用除氧步骤, 空气中存在的氧气会对实验结果造成较大的干扰, 而INT检测污泥脱氢酶活性实验则可在有氧条件下进行。在密闭静置培养条件下 (一定程度上排除氧气的干扰) , DHA测定值与菌液浓度的关系不呈线性, 可能也与培养过程中溶液中存在的溶解氧有关。 在目前的试验条件下, 实验过程中要完全消除氧气干扰难度较大, 同时考虑到TTC法需在高温下进行萃取, 操作较复杂, 最终选择了INT法进行后续研究。 2.2 乙醇-dmso萃取 当采用标准菌培养物代替活性污泥进行DHA检测时, 按文献方法 但用二甲亚砜 (DMSO) 作为萃取剂时, 由于DMSO的密度较大 (约为1.1 g/cm 经过比较, 结果表明以DMSO与乙醇相同体积混合后作为萃取剂, 既能达到降低萃取液密度的