表达ndvf蛋白的mdv疫苗株cvi488bac重组病毒的构建.docxVIP

表达ndvf蛋白的mdv疫苗株cvi488bac重组病毒的构建 马丽氏病（md）是马丽氏病（mdv）引起的严重免疫抑制和内脏肿瘤的重要疾病。 疫苗免疫可有效预防鸡发生MD，降低死亡率 新城疫(newcastle disease,ND)是由副黏病毒科的新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，被我国列为A类动物疫病。疫苗接种是预防ND发生的主要方法。1945年，ND灭活疫苗在美国批准销售，但因其无法完全预防疾病且成本较高，未被广泛使用 F蛋白是NDV的主要抗原和毒力因子，参与病毒感染入侵及细胞间传播 1 材料和方法 1.1 聚合酶、rtaq基因及鸡胚 pc DNA3.1-F-kana质粒、CVI988 BAC质粒由本实验室保存;2K plusⅡMarker、Prime STAR Max DNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SPF鸡胚购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;DMEM培养基购自北京索莱宝科技有限公司。 1.2 f基因的集合，cmi988bac的装载 1.2.1 pcna扩增 通过Primer 5设计两对引物(表1)，分别用于UL3/4位点的F-Kana基因的扩增以及阳性克隆筛选鉴定。以pc DNA3.1-F-Kana质粒为模板扩增F-Kana片段，反应体系为50μL:Prime STAR Max DNA聚合酶25μL，上下游引物各1μL，模板1μL，补水至50μL。反应程序:95℃5 min,(95℃30 s,55℃30 s,72℃3 min)×30个循环，72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。 1.2.2 阿拉伯糖诱导i-scei基因缺失菌株的构建 将实验室保存的CVI988 BAC菌株活化，42℃热激15 min，冰浴3～5min，离心弃去上清，制备感受态细胞，向感受态细胞中加入回收的目的片段，轻弹混匀，移到预冷的电转杯中，设置电转仪程序1 800 V,100Ω，2.5μF进行电转，电转结束后立即向电转杯中加入1 m L SOC,30℃孵育3h后，涂布于含有氯霉素(25μg/m L)、氨苄(50μg/m L)、卡那霉素(25μg/m L)抗性平板上，30℃培养48 h，筛选阳性单克隆菌株。然后向阳性菌液中加入终浓度为0.5%的阿拉伯糖诱导I-Sce I内切酶表达进而敲除Kana抗性基因。48 h后将板上的单个菌落接种到氯霉素、氨苄抗性平板和氯霉素、氨苄、卡那抗性平板上进行筛选，对成功去除Kana抗性基因的菌落进一步进行PCR鉴定，筛选阳性菌株。 1.3 病毒的急救和重组 将鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast,CEF)培养于含有5%FBS的DMEM中，置于37℃，5%CO 1.4 sds-采用凝胶电泳 分别取500 PFU CVI988 BAC-F病毒、CVI988 BAC病毒接种到铺满CEF的60 mm细胞培养皿中，同时设置不接种病毒的CEF细胞作为空白对照，待细胞出现明显的细胞病变时收获细胞，冰浴PBS洗涤2次，加入500μL RIPA裂解液裂解细胞，冰上放置5 min后刮下细胞，14 000 g离心10 min，吸取上清，加入5×SDS上样缓冲液100℃煮沸10 min，取20μL进行SDS凝胶电泳。将蛋白转印到PVDF膜上，加入5%的1×PBST稀释的脱脂牛奶，室温封闭1 h，分别用2 m L1∶2 000倍稀释的MDV g B单克隆抗体和NDV多抗血清室温孵育1 h,PBS洗涤3次，每次5 min，然后分别加入2 m L 1∶3 000倍稀释HRP标记的羊抗鼠和羊抗鸡二抗，室温孵育1 h,PBS洗涤3次，每次5 min，加入超敏ECL化学发光显影液，利用GE Healthcare蛋白成像系统成像。 1.5 mdvgb单克隆抗体和ndv多抗血清的制备 利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)检测重组病毒蛋白的表达。检测步骤简述如下:取100 PFU拯救的病毒接种到35 mm细胞平皿中，同时设置不接种病毒的对照组，感染5～7 d后细胞出现明显细胞病变，弃去培养基，PBS洗涤2次，向每个平皿中加入1 m L冰冻的细胞固定液(甲醇∶丙酮=3∶2)，室温固定4 min后，将细胞固定液用移液枪沿侧壁吸出，在通风橱下吹干。向固定好的细胞板中加入5%的1×PBS稀释的脱脂牛奶，室温封闭30 min。PBS洗涤3次，每次5 min，分别在细胞平皿上加入500μL 1∶500倍稀释的MDV g B单克隆抗体和NDV多