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猪弓形虫间接血凝试验检测猪抗体水平的研究 新伤口疾病是指由肺、淋巴结、肝脏、脾脏、脑等组织细胞引起的急性和热性原生动物。这是人类和其他动物的共病。人或动物通过摄入被刚地弓形虫卵囊污染的食物或水源, 或通过摄食含包囊的肉而被感染。在美国, 猪肉是被认为引起人感染弓形虫病的主要传染源。弓形虫病对人类健康危害极大, 可造成孕妇流产、死胎、畸形儿、弱智儿等一系列围产期疾患, 同时它也是神经系统和眼科疾患的主要病原之一。因此该病给人类健康和畜牧业发展带来极大危害和威胁。为了解新乡市待宰猪弓形虫的感染情况, 通过弓形虫正向间接血凝试验 (IHA) , 进行弓形虫感染的血清学调查。 1 材料和方法 1.1 间接血凝抗原、阴性血清、阳性血清 样品来自新乡市某屠宰场的待检猪, 随机采集血液50份;弓形虫间接血凝抗原、阴性血清、阳性血清及稀释液, 购自中国农科院兰州兽医研究所。试验器材:微量移液器, 96孔“V”型微量反应板, 微型振荡机, 生化培养箱, 电热恒温水浴锅。 1.2 测试方法 1.2.1 离心诊断液组 按冻干抗原瓶签所标毫升数用灭菌蒸馏水稀释摇匀, 放入灭菌离心管中, 1 500~2 000 r/min离心10 min, 弃去上清液, 加等量稀释液摇匀, 之后置于4℃冰箱中放置24 h, 作为诊断液使用。稀释后的诊断液要在10 d内用完, 否则弃用。 1.2.2 血清消活 将血样置于37℃生化培养箱中1 h, 之后置4℃冰箱, 自然析出血清, 将血清抽出装入小离心管中, 于56℃水浴锅中灭活30 min, 4℃保存备用。 1.2.3 血清清髓反应 反应在96孔“V”型微量反应板上进行, 每块血凝板设待检血清、阳性血清、阴性血清和稀释液对照孔。用移液器加稀释液于96孔“V”型微量反应板上, 每孔75μL。稀释液于阳性、阴性血清对照孔各加8孔, 被检血清孔各加4孔。 1.2.4 第7孔第7孔 在第1孔加阳性血清、阴性血清和待检血清各25μL, 混匀, 稀释, 用移液器移取25μL置于相应第2孔内, 按此法依次往后稀释, 稀释到第7孔或第3孔, 最后弃去25μL, 每孔内的液体量为75μL。每排的最后一孔为稀释液对照孔。 1.2.5 血球的下反应板、下纸板、背景纸的制备 每孔加25μL诊断液, 加完后将反应板置于微型振荡器上, 振荡1~2 min, 直到诊断液中的血球分布均匀。取下反应板, 盖上一张与反应板大小相等的干净纸, 以防止灰尘落入。置于37℃下作用2~3 h, 判定结果。 1.2.6 血清抗体效力 以50%红细胞凝集 (++) 的最高稀释倍数判定为该血清的凝集价 (效价) 。在阳性对照血清滴度不低于1:1024 (第5孔“++”) , 阴性对照孔血清除第1孔允许存在前滞现象 (+) 外, 其余各孔及稀释液对照孔均为“-”的前提下, 对待检血清进行判定。血清抗体效价≥1∶64者判为阳性;效价≤1∶64者判为阴性。最后统计阳性率。 2 猪弓形虫抗体阳性率低,存在时猪马 由表1可以看出, 在50份待宰猪被检血清样品中, 弓形体抗体的阳性数为7份, 阳性率为14%。此结果较1989年河南省人畜弓形虫病调查协作组对武涉县调查的猪弓形虫抗体阳性率 (49.41%) 、1992年杜重波等对发生猪流产的甘肃省高台县种猪场调查的弓形虫抗体阳性率 (41.5%) 和1996年毕运龙等对云南省53个县调查的猪弓形虫抗体阳性率 (26.4%) 低;与1998年张德林等对甘肃省天祝县调查的猪弓形虫抗体阳性率 (13.8%) 、2006年王天奇等对洛阳地区部分规模化猪场调查的弓形虫抗体总阳性率 (16.5%) 和育肥猪的阳性率 (11.3%) 接近。说明猪弓形虫的感染率目前趋于平稳, 猪群感染率与样品采集的对象、时期、地区, 以及饲养管理状况和猪健康状况等因素有关。 3 结论和讨论 3.1 弓形虫感染情况 屠宰场的待宰猪来自新乡市的养猪专业户或散养户, 饲养方式为圈养, 饲喂配合饲料, 这种饲养方式在一定程度上限制了猪弓形虫的感染和传播。待宰猪的弓形虫抗体阳性率为14%, 说明新乡市猪群依然存在弓形虫的感染, 可能与目前猪场老鼠成灾、猪场养猫灭鼠和农村流浪猫增多等因素有关。建议相关部门设立流浪猫收容所, 对流浪猫进行收容、去势和领养等工作。猪场禁止养猫, 加强饲料保管, 严防被猫粪污染, 同时做好灭鼠工作。新乡市城郊有饲喂泔水的猪, 主要销往外地, 所采样品并没有涉及。 3.2 弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试验条件 用弓形虫正向间接血凝试验检测人或动物弓形虫感染的循环抗体, 在感染后12 d左右即可检出, 并且循环抗体可在1~2年内维持较高水平, IHA法具有简便、快捷、特异、对试验条件要求不高等特点, 适合弓形虫感染的流行病学调查。2007年王艳华等研