野木瓜多糖中蛋白质含量测定方法的研究.docxVIP

野木瓜多糖中蛋白质含量测定方法的研究 野生黄瓜是贵州省遵义正安县独特的野生自然资源。它是蔷薇科和秋海棠灌木的一种附着。正安县野木瓜品质独具特色,具有果大、皮薄、肉厚、肉质细嫩、味甘酸、气香等特点。木瓜在中医药学中用途广泛,《中医大辞典》、《本草纲目》、《本草拾遗》等著名医著都记载了木瓜具有舒筋活络,解渴生津、平肝和胃、祛风除湿等功效,能治疗腰膝疼痛,脚气水肿,痢疾霍乱,心痛腹痛等疾病,另外,还有镇咳、清暑利尿、解酒祛痰等作用。现代研究表明,野木瓜含有丰富的有机酸、果胶、蛋白质、多种氨基酸、多种维生素和多种矿物质。 多糖是野木瓜中有效成分之一,野木瓜粗多糖中含有多种杂质,影响其多糖纯度最主要的物质为杂蛋白。如何快速,简单,准确地对其中的蛋白质含量进行检出,无疑将直接影响着野木瓜多糖的纯化效率和开发应用。蛋白质作为一项质量和资源评价的重要指标,其含量必需明确,故探索测定野木瓜多糖的蛋白质含量方法有重要的意义。目前关于野木瓜多糖中蛋白质含量的测定方法还鲜有报道,本实验采用考马斯亮蓝G-250染色法对野木瓜多糖中蛋白质含量进行测定,与其它方法相比,该法简单、迅速,且相对较为准确,是测定野木瓜多糖中蛋白质含量的有效方法。 1 主要材料、设备和原则 1.1 实验试剂和试剂 野木瓜:贵州遵义天楼野木瓜有限公司提供;野木瓜多糖:本实验室自制;牛血清白蛋白:进口分装,Sigma公司;考马斯亮蓝G-250:进口分装,中国医药集团上海化学试剂公司;其它试剂均为国产分析纯试剂。 1.2 仪器、仪器和仪器 HH·SH-Z型电热恒温水浴锅:北京长安科学仪器厂;ZK-828型电热真空干燥箱:上海跃进医疗器械厂;DWF-180型电动植物粉碎机:河北省黄骅市科研器材厂;SL2000电子天平:澳豪斯公司;UV2550紫外可见分光光度计:岛津公司;N-1000V-WB旋转蒸发仪:日本东京理化器械株式会社;DL-5型离心机:上海安亭科学仪器厂。 1.3 蛋白质含量测定 蛋白质分子均具有酰胺基团,棕红色的考马斯亮兰G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺结合,使溶液变为蓝色,其最大吸收峰也由465 nm变为595 nm,蛋白质在1μg~1 000μg范围内,蛋白质与色素物质结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于测定蛋白质含量。 2 方法 2.1 蛋白质标准液的制备 精确称取牛血清白蛋白10.00 mg,用少量蒸馏水溶解定容至100 m L,即为0.1 mg/m L蛋白质标准液,4℃~5℃冰箱中保存。 2.2 试剂制备考马斯亮蓝g-200 精密称取考马斯亮蓝G-250 100.00 mg加入95%乙醇50 m L,再加入85%磷酸100 m L,最后用蒸馏水定容至1 000 m L,最终试剂含0.01%考马斯亮蓝G-250,4.7%乙醇,8.5%磷酸,置于棕色瓶中备用。 2.3 试验溶液的制备 精确称取野木瓜多糖100.00 mg,加蒸馏水溶解定容至100 m L,即为1 mg/m L供试品溶液。 2.4 测试程序和方法:考马斯亮蓝g-200学生,10.10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.8、10.9、10.9、10.9、10.8、10.8、10.9、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9,10.9.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8 分别精密吸取标准蛋白质溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0 m L于10 m L具塞试管中,各管加水至1 m L,加入考马斯亮蓝G-250溶液5 m