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神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响 0 骨组织中神经纤维的生长 骨折修复是一个非常复杂的过程，是由多种组织和因素共同作用的结果。神经系统对骨折愈合有作用早在150年前就有人通过大体解剖发现，骨组织中存在神经纤维在解剖学上得到证实；神经生长因子是1952年发现的，它主要被用于维持交感神经和感觉神经纤维存在和促进神经突起生长的作用。但近年来发现其在神经系统外的作用也很显著，尤其是随着神经系统对骨折愈合研究的深入，对其在骨组织中的靶细胞作用的研究更是成为热门。实验通过治疗性给予胫骨骨折模型大鼠神经生长因子观察其对骨折冶疗是否有作用。 1 骨髓细胞微核试验 设计：随机对照动物实验。 时间及地点：实验于2005-06/2006-03在解放军第二军大学动物实验中心完成，实验室生物防护水平BSL-2。 材料：健康雄性3个月龄SD大鼠120只(中科院上海实验动物中心提供)，体质量250～300 g，随机分为2组：单纯左胫骨骨折组；神经生长因子治疗组，每组60只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。 注射用神经生长因子由厦门北大之路生物工程有限公司提供。 实验方法： 胫骨骨折的制备：100 g/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，折断胫骨上1/3处，平台前缘插入克氏针行髓内固定，术后石膏固定。术后3～5 d内肌注青霉素(50 mg/kg)。 神经生长因子的配制及应用:将每瓶6 000 U包装的神经生长因子冻干粉(注射用神经生长因子)用1 m L生理盐水充分稀释,参照文后文献剂量，肌注2 000 AU(1.4 g)，1次/d,分别注射两侧腓肠肌，连续肌注2周。骨折后4周处死动物取组织标本进行观察。 生物力学的3点折弯试验：取大鼠胫骨进行3点弯曲试验测定断裂能量、大鼠胫骨的柔度比、大鼠胫骨愈合时的相关力学性能参数、大鼠胫骨的愈合强度、大鼠胫骨的愈合刚度。 骨痂成骨细胞超微结构的观察：将新鲜骨痂尽可能锯成1.0～2.0 mm3大小放入脱钙液中，直到用针头可刺透标本，送至解放军第二医科大学电镜室制片观察。 Western印迹检测骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达：标本脱钙1周，取脱钙骨组织按组织裂解法提取蛋白；Bradford法测定蛋白浓度，上样量60μg，用夹心方法把滤纸，凝胶，硝酸纤维素薄膜依顺序放好，插入电转移槽中，并加入电转移缓冲液，100 V电压下转膜100 min。取出硝酸纤维素薄膜置入2%BSA/PBST液中37℃封闭2 h，加入Ⅰ型胶原的一抗(1∶1 500)，4℃冰箱过夜，次日漂洗硝酸纤维素薄膜3次，再加入2抗(1∶2 000)，室温2 h,取出再次漂洗3次，用ECL RegentA,RegentB(1∶1)混匀后涂抹于硝酸纤维素薄膜上，反应5 min；用塑料保鲜膜包裹后固定于压片匣中，曝光显影。将X射线胶片置于Gel Doc2000图像分析系统，测定目的条带的平均吸光度值，并将5次实验结果的平均值作为蛋白含量的相对值。采用生物电泳图像处理系统对免疫复合物进行分析，以各组产物吸光度值与β-actin吸光度值的比值作为各组产物相对吸光度值。Ⅱ型胶原测定方法同Ⅰ型胶原。 主要观察指标：(1)骨折断端横截面最大直径及断面骨痂灰度值。(2)生物力学的3点折弯试验结果。(3)骨组织计量学的比效。(4)骨痂组织形态学的观察结果。(5)骨痂中骨钙素的表达。(6)骨痂中成骨细胞的超微结构。(7)骨痂中Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白的表达。 统计学分析：计量数据以表示，由第二作者应用SARS软件处理，组间比较采用t检验，P0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 动物的数量分析 实验选用大鼠120只，分为2组，脱失6只，进入结果分析114只。 2.2 学性能试验结果 通过2组大鼠胫骨的3点折弯试验，得到大鼠胫骨愈合过程中弯曲力学性能试验结果，见表1。 结果表明，神经生长因子治疗组在弯曲刚度、弯曲强度、弯曲挠度、弯曲载荷弯矩、比挠度λ等6项指标均优于单纯左胫骨骨折组，统计学显示差异有显著性意义(P0.05)。 2.3 各组细胞的平均形态 透射电镜下见神经生长因子治疗组成骨细胞呈突起显著，细胞边缘不光滑，皱折明显；单纯左胫骨骨折组的细胞突起细长，细胞边缘略有皱折。细胞内的细胞器主要表现在粗面内质网数量及形态上有不同，神经生长因子治疗组粗面内质网粗大，扩张明显，可见到数量多的高尔基体。见图1。 2.4 两组患者治疗前后神经生长因子治疗组p0.1的比较见表1 伤后4周单纯左胫骨骨折组Ⅰ型胶原蛋白表达明显低于神经生长因子治疗组(P0.01)；单纯左胫骨骨折组骨痂中Ⅱ型胶原蛋白的表达明显高于神经生长因子治疗组(P0.05)。见图2。 3 神经生长因子与骨折愈合的关系 临床中发现失神经可导致骨折断端骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化，这一现象提示神经因素对