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三七组织培养研究进展 三七（b.h.chen），又名田七，是五加科的一种植物。它享有“金不换”、“南方蚕草”、“人参之王”等美誉。这是中国传统的优质中药。三七味甘、微苦、性温,具有防治癌症、抗衰老、抗疲劳、抗炎、降血压、降血脂等多方面的药理作用和保健功能,其主要药理活性成分是皂苷,目前尚不能人工合成。三七对生长条件要求苛刻,全世界仅云南省文山州以及广西部分地区适宜生长,加之生长周期长、病虫害严重、连作障碍、农药残留等问题,市场上三七资源供不应求。通过组织培养技术,既可快速繁殖三七种苗,又可直接生产次生代谢物,是有效解决上述问题的途径之一。本文将对国内外三七组织培养研究进展做一综述。 1 愈伤组织的诱导 在三七组织培养过程中,不管是进行种苗快速繁殖,还是次生代谢物生产,愈伤组织的诱导是首要的重要步骤,在愈伤组织诱导中,外植体的选择、激素的种类组合与浓度关系着组织培养效果的好坏甚至成败。 1.1 争议外植体的诱导 由于细胞具有全能性,故三七各器官均能诱导出愈伤组织,但诱导率差异甚大。因此,筛选出愈伤组织诱导率高的器官作为三七组织培养的外植体至关重要。郑光植等研究表明:无论生长速率和干重增加、粗皂苷含量和产率、粗皂苷元含量、主要皂苷成分Rg1、Rb1和Rh1及其含量、皂苷组成还是诱导愈伤组织的频率及速率,都以茎作为外植体诱导的愈伤组织更为优良。高先富等认为幼嫩花蕾愈伤组织是诱导不定根的理想材料。段承俐用花药作为外植体诱导愈伤组织,取得了较好的效果。由此可见:三七愈伤组织取材广泛,可根据研究目的选用不同的外植体。一般情况下选用茎作为外植体会取得不错的效果;用幼嫩花蕾作为外植体有利于不定根的诱导;从事单倍体方面的研究则应选用花药作为外植体。 1.2 植物生长调节剂的选择 植物生长调节剂又称植物激素,包括细胞分裂素、生长素等。细胞分裂素和生长素搭配使用可诱导植物脱分化形成愈伤组织,被广泛应用于植物组织培养。但不同的植物对植物生长调节剂的种类和浓度的反应不尽相同。因此,需要筛选出适合三七愈伤组织诱导的激素组合与浓度。目前,在三七组织培养中,用于愈伤组织诱导的生长素大多使用2,4-D,浓度一般为2 mg·L-1左右;搭配使用一定浓度的细胞分裂素效果更佳,目前大多使用KT,浓度一般为0.5~0.7 mg·L。 1.3 基本组成的选择 目前,三七组织培养中,用于愈伤组织诱导的基本培养基主要是MS培养基。也有少数研究使用6,7V。 1.4 培训条件 三七愈伤组织诱导一般是在黑暗条件下进行,光照有一定抑制作用,温度和p H值一般分别为25℃和5.8。 2 细胞悬浮剂的制备 三七与其下游产品的药效成分主要集中在皂苷,通过组织培养技术可以实现皂苷规模化生产。用植物悬浮细胞培养技术生产次生代谢物质已成为当代生物制药的一个重要领域;通过诱导愈伤组织、筛选培养条件、选择优良培养体系和添加合适诱导物质等方法,可以进行细胞原的批量生产,然后分离提取得到代谢产物。这种生产方式得到的次生化合物含量往往比植物体高出2~5倍,而且细胞悬浮培养生产次生代谢物质具有不受各种外界环境的影响、繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物培养物等优点,适于大规模的工厂化生产。 日本、韩国通过细胞培养、不定根培养已实现了人参皂苷的工厂化生产。而三七在这方面的研究起步较晚,郑光植等进行了较为系统的研究,对外植体类型、培养基、培养条件、外源激素、培养基天然补充物等影响因子进行了研究,使三七愈伤组织的生长速率达220 mg·L-1·D-1,愈伤组织中总皂苷含量达13%。侯篙生等用5 L气升式反应器培养细胞,发现外循环反应器中三七总皂苷含量达9.48%;内循环反应器中三七多糖含量达24%,但三七细胞生长比较缓慢。周立刚等(1992)用10 L的搅拌式发酵罐对三七细胞进行发酵培养,皂苷含量为干重的11.21%,皂苷产率为1513.3 mg·L-1,细胞培养物产率为每月13.58 g干重·L-1,均比悬浮培养高。甘烦远等研究了人参寡糖素对三七悬浮培养细胞生长的效应,发现人参寡糖素对三七悬浮培养细胞的生长具有明显的促进作用。 3 培养抗伤能力 根据研究目的的不同,可通过调节培养基中细胞分裂素和生长素的种类和浓度,诱导愈伤组织产生不定根或者不定芽。如果是为了生产次生代谢物,则诱导不定根,进而对不定根进行继代增殖培养,扩增出大量不定根后从中提取皂苷等次生代谢物;如果是为了获得组培苗,则诱导不定芽,继而诱导生根,从而形成完整的组培苗用于栽培或其它研究。 3.1 采用微气培养的材料材料 人参不定根培养已成功实现了工业化,反应器规模达到10000 kg,而三七在这方面处于起步阶段。高先富等研究表明:幼嫩花蕾愈伤组织是诱导不定根的理想材料;IBA诱导不定根的能力最强;采用将不定根连其母体组织一起在液体培养系