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难治性癫痫患者术后对淀粉样蛋白表达的影响 ii类淀粉蛋白（i-app）是淀粉样蛋白的代谢产物。根据最近的研究，i-app的过度表达可以促进轴突的扩张，促进其多向生长。轴突异常生长是异常生长和抗癫痫芽形成的重要分子基础。因此，对抗癫痫药物的研究对于阐明抗癫痫药物的产生机制非常重要。我们联合应用免疫组化和免疫荧光法检测β-APP在耐药性癫痫患者颞叶和海马组织中的表达,并探讨其在耐药性癫痫芽生形成和神经网络重建中的作用,现报道如下。 1 数据和方法 1.1 病例选择及一般资料 实验组37例患者来自2004年12月～2006年7月在广东省三九脑科医院,第三军医大学新桥医院和重庆医科大学附属第一医院神外科进行手术治疗的耐药性颞叶癫痫患者。为了排除年龄老化因素对实验结果的影响,实验组的患者均为中青年且对照组与其年龄匹配。其中男性20例,女性16例,年龄14～56岁,平均30.5±12.98岁;病程3～46年,平均18.73±13.45年;其中复杂部分性发作7例,简单部分性发作合并复杂部分性发作2例,复杂部分继发全身强直-阵挛性发作例21,强直性发作2例、多种类型的发作4例(强直-阵挛性、强直性、阵挛性,复杂部分性)。共收集颞叶标本34例,海马标本7例。对照组15例系在我院因意外死亡的患者,所有对照组患者符合下列条件:①无癫痫病史和家族史;②无颅内肿瘤、外伤或神经系统进行性疾病;③病理切片证实脑组织结构正常;④家属同意,并签署知情同意书;⑤收集脑组织标本时间在患者死亡后16小时内。其中男7例,女8例,年龄19～53岁,平均38.13±10.86岁,共获颞叶15例,海马5例。 所有患者均符合以下条件:①符合吴逊、沈鼎烈难治性癫痫定义,经正规服用过三种或三种以上一线抗癫痫药(苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸、苯巴比妥),发作频率没有明显减少;②无明显病因可寻,神经系统体格检查没有局灶性神经系统体征或虽有体征但与癫痫发作无关;③头颅CT或核磁共振检查除海马硬化外,没有其他异常;④患者的发作类型符合国际抗癫痫联盟1981年有关癫痫发作类型分类的规定;⑤术前定位及术中皮质电极监测发现有明确和固定的癫痫放电部位,有手术适应症,且能进行手术者;⑥患者及其家属术前签注知情书。 1.2 实验方法 1.2.1 样本收集 实验组和对照组标本获取后,置于4%多聚甲醛固定48小时,随后常规石蜡包埋切片,常温保存备用。术后标本同时送常规的病理检查。 1.2.2 组织病理学观察 两组石蜡标本用石蜡切片机行连续冠状切片,片厚4～6 μm,每个标本分别制备10张切片,排序,完成后,每个标本随机抽取2张,行伊红染色观察耐药癫痫脑组织的病理形态变化。 1.2.3 抗人抗体part 石蜡切片常规脱水,抗原热修复20 min后0.3%催酮混合1%牛血清蛋白穿透1h,山羊血清封闭5h,加入一抗β-APP兔抗人抗体(Santa Cruz,USA),滴度1∶100,室温孵育16h,洗去一抗,加FITC标记的山羊抗兔抗体(北京中杉生物公司),室温下孵育3h,洗去二抗,甘油混合PBS封片。激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems Heidelberg GmbH,Germany)行激光扫描图像采集。实验组及对照组每张切片上选取5个视野,测平均荧光强度值。 1.3 数据统计分析 采用SPSS11.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析(One Way ANOV),数据用平均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,两组数据比较时若方差齐用t检验,方差不齐用t’检验,P0.05为有显著性差异。 2 结果 2.1 病理形态试验结果 HE染色显示耐药性颞叶癫痫脑组织和海马中有不同程度的神经元丢失,变性,胶质细胞增生和轴突走向紊乱(图1)。 2.2 -app阳性细胞 激光共聚焦扫描结果显示耐药性癫痫颞叶和海马组织内均可见大量绿色荧光着色的β-APP阳性细胞,在胞浆和轴突均有沉积,而对照组极少见阳性细胞(图2)。免疫荧光强度值分析结果显示β-APP在耐药性癫痫脑组织中表达较对照组明显增高且有统计学意义(表1)。 3 -app促进海马神经网络结构的改变 尽管引起难治性癫痫的病因非常复杂,但苔藓纤维芽生和神经元网络重组仍然是难治性癫痫最为明显的病理特征,神经元网络重组可能通过改变痫样放电的传播方向和路径,避开抗癫痫药物作用的一些重要靶点,导致难治性癫痫的形成。但由于芽生形成和神经元网络重组机制不清楚,无法对耐药性颞叶癫痫作出早期诊断和进行有效治疗,因此,研究与芽生机制密切相关的基因表达有利于揭示耐药性癫痫形成机制,并为寻找新的治疗途径提供重要线索。 β-APP是APP加工的正常产物,主要在中枢神经系统表达,正常成熟脑中仅有少量的β-APP表达。β-APP与细胞骨架蛋白之间存在着紧密的内在联系,正常的β