人牙周膜干细胞的分离纯化及生物学特性研究.docxVIP

人牙周膜干细胞的分离纯化及生物学特性研究 通常，牙周组织具有很强的修复能力，其修复活动通过从牙周膜上不同细胞的定向运动和分化来实现。疾病或在受到外界刺激时, 通过牙周膜中未分化的间充质细胞的不断增殖和分化使组织再生。进一步研究发现, 牙周组织发育完成后, 存在于牙周膜中的这种未分化的间充质细胞具有自我更新和多向分化等成体干细胞的特点, 能形成牙骨质-牙周膜样复合体, 将其命名为牙周膜干细胞 (PDLSCs)。本研究体外分离培养了牙周膜干细胞, 并通过细胞超微结构观察、流式细胞周期分析及免疫组化染色等方法对其进行鉴定, 旨在从不同角度对其有进一步的认识。 1 材料和方法 1.1 vmenin公司 高糖型DMEM培养基;胎牛血清;胶原酶、胰蛋白酶、Dispase酶 (Gibco公司, USA) ;ABC型免疫组化检测试剂盒 (Dako公司, USA) ;鼠抗人波形丝蛋白单抗 (Vimentin) (Dako公司, USA) ;鼠抗人骨粘素 (anti-ON, BON-1) 单克隆抗体、鼠抗人骨涎蛋白 (anti-BSP) 单克隆抗体 (NIDCR, L. Fisher教授惠赠) 、鼠抗人STRO-1单克隆抗体 (Santa Cruz公司) ;平底96孔板 (Nunc公司, USA) ;倒置相差显微镜及照相系统 (Olympus公司, Japan) ;流式细胞分析仪 (Coulter公司, USA) ;70 μm细胞筛网 (Falcon公司, USA) , JEM-20000EX透射电镜 (JEC公司, Japan) 。 1.2 细胞的分离和提取 1.2.1 细胞培养和传代 收集临床上正常人拔除的牙周健康、无龋的新鲜第三磨牙, 刮取根中1/3牙周膜组织, 移入离心管内, 加入3 mg/ml的I型胶原和4 mg/ml Dispase 轻轻震荡, 37 ℃下消化1 h, 通过70 μm筛网, 获得单个离散的细胞, 调整细胞密度为1×104/ml接种于5 ml培养基 (含200 ml/L胎牛血清, 100 μmol/L-抗坏血酸, 2 mmol/L-谷胺酰胺, 100 U/ml青霉素, 100 μg/ml链霉素的DMEM培养基) , 37 ℃、50 ml/L二氧化碳的孵箱中培养, 3 d后更换培养液弃去未贴壁的细胞, 2~3 d换液1 次, 收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用, 细胞生长达80%汇合时传代。 1.2.2 适应性培养基 将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清按1 500 r/min离心10 min, 经0.22 μm直径的小滤器过滤后, 与培养基以1∶1比例混合作为适应性培养基。取对数生长期的第一代细胞用适应性培养基倍比稀释, 调整细胞密度至10~15 个/ml, 吹打混匀, 接种于96 孔培养板中, 100 μl/孔, 培养12 h后标记单个细胞孔, 并补液至200 μl/孔, 5 d换液, 待克隆长至孔底1/3~1/2后胰酶消化, 扩大培养。 1.3 流式细胞术检测细胞周期 将牙周膜干细胞扩大培养至约1×107/ml, 胰酶消化, PBS洗后, 加0.01 mol/L PBS重悬细胞, 吹匀后加入预冷的无水乙醇2 ml 吹打混匀, 4 ℃过夜, 离心弃乙醇, 0.01 mol/L PBS洗2 遍, 加入5 ml/L的PI (碘化丙锭) 1 ml, 4 ℃染色30 min, 过300目的尼龙筛网, 流式细胞仪上机, 进行细胞周期检测。 1.4 常规透射电镜检测细胞分离 将牙周膜干细胞扩大培养至约1×107/ml, 胰酶消化, 0.01 mol/L PBS洗1 遍, 收集于小离心管内, 1 500 r/min离心10 min, 弃上清, 25 ml/L戊二醛液4 ℃固定细胞团块后, 常规透射电镜标本固定、脱水、包埋、切片、染色、观察。 1.5 免疫组化染色 取生长良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片, 用免疫细胞化学ABC法染色进行Vimentin、STRO-1、ON、BSP免疫组化染色, 阴性对照用PBS替代一抗, 其余步骤不变, 进行细胞来源及表达检测, 光镜下观察。 2 结果 2.1 细胞生长和培养成功率 酶消化法原代培养的人牙周膜细胞6 h大部分细胞贴壁, 24 h开始伸展, 72 h大部分细胞伸展, 约15~18 d达到90%汇合。培养成功率低, 本实验共取材22 例, 培养成功6 例。细胞大多数长梭形, 1~2 个突起, 少数为多角形、纺锤状或椭圆形, 体积较小, 胞体丰满 (图 1) 。 2.2 胞克隆形成率 采用适应性培养基, 96 孔板克隆化培养。10~15 d有细胞克隆形成。此实验培养的细胞克隆形成率为0.62%。镜下观克隆状生长的细胞形态呈梭形, 体积较小, 细胞之间排列紧密, 中心部细胞界限不清