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利用基因敲除技术优化微生物代谢途径 微生物种类繁多，数量众多。这是自然的瑰宝。随着科技的发展,发酵工业与生物催化向人们提出了更高的要求,进一步提高目的产物的产量、纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决的问题,因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改造,以获得高产高效的工业菌株。传统的育种手段存在工作量大,效率低,遗传稳定性差等缺点。随着对微生物代谢机理认识的不断加深,随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程的发展,定向操纵遗传变化成为可能,代谢工程应运而生。 代谢工程的概念诞生于1991年,具体而言,代谢工程就是利用重组DNA及其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。对于工业微生物育种来说,从野生出发菌株到高效生产菌株,需要经过代谢分析—设计策略—遗传修饰—代谢分析这一流程,不断的循环调整,对宿主进行遗传修饰为其中的重要一环,包括DNA shuffling, genome shuffling及基因敲除技术,这些DNA重组手段可以快速改变分散在基因组不同位置上的一个或数个基因,从而改变相应的细胞表型,快速优化代谢途径,极大地促进代谢工程的进一步发展和应用. 基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用微生物体内的同源重组系统,在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组,从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量,从而达到微生物育种的目的。 1 同源重组病毒的检测 基因敲除的一般流程见图1,基本程序是:用PCR技术扩增目的基因序列,在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记,使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上,用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内,以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测,再以PCR,southern杂交等做进一步验证。现在,为了更好地区别单交换与双交换造成的重组,通常使用两个抗性标记,在发生单交换时,阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组,而发生双交换时,第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因,在前一种情况下,两种标记都不存在;在后一种情况下,基因组上只有阳性标记,因此这样的敲除子可以通过正负筛选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变,就不会回复至野生型,这样,既能实现基因的失活,基因组上又不会带有抗性标记,这对构建“食品级”的安全菌株是有益的。 在了解微生物代谢途径相关基因的基础上,通过构建合适的敲除载体,利用微生物原有原因与构建的同源重组系统发生交换,进行代谢旁路的阻断,防止副产物或有毒产物的形成,促进目的产物积累,从而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。基因敲除技术既对敲除载体的要求不高可用于原核细胞,也可用于真核细胞,用途广泛。 2 同源重组子的筛选和检测 基因敲除过程中,敲除载体的设计及构建是非常重要的。同时,在载体构建的过程中要考虑建立合理、可靠的筛选方法。同源重组的效率较低,故对重组子的筛选和检测是基因敲除的关键步骤。目前根据不同的目的和要求,基因敲除的策略主要有以下几种。 2.1 敲除质粒的制备 对野生菌做基因敲除,可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的,因此转化之后,在选择压力下,未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。丁晓明等利用在地中海拟无枝菌酸菌中不复制的敲除质粒PDK110,成功地用α-淀粉酶基因取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺点是整合几率低,需要数千碱基的同源序列,且对受体菌的感受态效率要求较高。 2.2 -kr基类 若受体菌感受态较难制备,可考虑采用不稳定型敲除载体。例如:2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是维生素C合成的重要前体,但发现存在高水平的2-酮基醛糖还原酶(2-KR)活力。由于2-KR能够利用NADPH或NADH辅酶将Vc生产菌代谢中重要的中间产物2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)及2-KLG转化为其他副产物,陈芳等将失活的2-KR基因构建到pBR322衍生质粒上,这种质粒在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5~10代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目,然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失,最后在选择压力下筛选敲除子。目前已成功敲除2-KR基因。 2.3 确定质粒的确定使用方法 1993年,Biswas等利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。Biswas所用质粒pG+ hos