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植物中小分子rna的高通量测序研究进展 0 焦磷酸高通量测序技术 小分子rna（小型钠）是一个非编码的rona分子，具有20.30%的长度。自从1993年首次在秀丽线虫(Caenorhadits,elegans)中被发现后,人们越来越多地意识到小分子RNA的重要作用。相对于小分子RNA的巨大数量,传统的Sanger测序法操作复杂,花费大,测序深度有限,效率较低,因此在很大程度上制约了植物小分子RNA的发现速度。自2005年以来,人们开始采用以大规模平行标签测序技术(massively parallel signature sequencing,MPSS)、454-FLX(454 life sciences)和Solexa(illumina)测序技术为代表的新型焦磷酸高通量测序技术(pyrosequencing)来发掘植物小分子RNA。这些第2代测序技术尽管获得的序列较短,但具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点,因此非常适合小分子RNA测序,尤其是对那些拷贝数低的小分子RNA。以最早发现的microRNA(mi RNA)为例,互补链的出现已成为衡量其是否为mi RNA基因的充分必要条件。而miRNA互补链在mi RNA形成后即进入降解途径,因而拷贝数极低,利用传统测序技术一般无法检测到。因此,高通量测序技术可大大促进植物小分子RNA基因的发现过程,为研究小分子RNA的合成机制和生物学功能及其在物种间的进化规律提供大量信息。 鉴于小分子RNA在植物生长、发育和应答外界胁迫等方面具有重要功能[12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23],有关其生物合成和功能研究已有多篇综述。所以,本文在简单介绍各种植物小分子RNA特点的基础上,侧重总结近几年利用高通量测序技术挖掘植物小分子RNA的研究成果,以期反映高通量测序技术在加速植物小分子RNA发现、促进植物小分子RNA功能研究以及提高人们对植物小分子RNA进化的认识等方面的最新进展。 1 植物小分子rna的合成 根据植物小分子RNA生物合成途径的不同,大致上可将其分为微小RNA(microRNA,mi RNA)和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)两大类型。其中si RNA又分为天然反义si RNA(naturalantisense si RNA,nat-siRNA)、反式作用si RNA(trans-acting siRNA,ta-si RNA)和异染色质小RNA(heterochromatic small RNA)。植物小分子RNA的生物合成过程需要多种蛋白和酶的参与。在拟南芥中,III型核糖核酸酶(dicer-like,DCL)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)以及Argonaute蛋白(AGO)等都是小分子RNA生物合成路径的重要成员。 1.1 mirna的形成 mi RNA是第一类被发现并具有重要功能的内源单链小分子RNA,其长度为20～23核苷酸。每种植物中有上百个编码mi RNA的基因(不同物种中的具体数目不一样),它们分别在不同的细胞和植物的不同发育阶段表达。mi RNA基因经转录后形成mi RNA的转录本(pri-miRNA),然后在HYL1(hyponastic leaves1)、DCL1和SE(serrate)的相互作用下形成mi RNA前体(mi RNA precursor或premi RNA)。Pre-miRNA能够形成具有茎环特征的二级结构。miRNA则位于茎环结构的茎上。一般来讲,pre-miRNA被DCL1切割形成miRNA/miRNA*寡核苷酸二聚体。这些二聚体经甲基转移酶HEN1(HUA enhancer1)对其3′末端碱基进行甲基化修饰后成为成熟mi RNA。然后成熟的单链mi RNA被组装到含有AGO蛋白的RISC(RNA induced silencing complex)中。而mi RNA*则被逐步降解。miRNA在RISC的引导下通过切割靶基因转录本或抑制其翻译来行使基因沉默的功能。 1.2 ta-sirna靶基因的结构 si RNA是一类由长的双链RNA(double strand RNA,ds RNA)产生的小分子RNA。基因组上的许多位点都可以产生si RNA。在植物中,内源si RNA可以直接来源于转录本、转基因的反向重复序列以及转座子等。到目前为止,3类siRNA的生物合成已比较清楚。第1类叫做nat-siRNA,它们产生于同一基因组位点上序列部分重叠的双向转录本,其生物合成需要RDR6及1个或2个DCL蛋白的参与。目前研究最清楚的2个nat-siRNA分别产生于生物胁迫和非生物胁迫条件下,通过下调参与产