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独活提取物i在大鼠体肠灌流中的肠吸收性质研究 在口药物制剂的处方之前的研究中，有必要研究药物在口服后的体内吸收部位和情况。小肠是大多数药物主要的吸收部位,预测药物小肠吸收的方法有离体和在体法。在体法因不损伤研究部位的淋巴和循环系统而明显优于离体法。其中大鼠肠单向灌流法(SPIP)能很好地模拟人体的体内环境,且结果与人体的试验结果相关性良好,目前在国内外得到了广泛的应用。 独活为常用中药,始载于《神农本草经》,药理试验有镇痛、镇静和收缩血管的作用。临床上主要用于治疗风寒湿痹,腰膝疼痛,少阴伏风头痛等。独活的有效成分为香豆素类,包括二氢欧山芹醇乙酸酯(columbianetin acetate),蛇床子素(osthol),二氢欧山芹醇当归酸酯(columbianadin),二氢欧山芹醇(columbianetin)等,主要是以单味或复方用药。研究口服中药活性成分的吸收部位和吸收机制对建立口服药物传输系统和理解中药作用的物质基础具有重要意义。本文采用不同工艺分别制得独活提取物I(总香豆素含量10%)和独活提取物II(总香豆素含量≥60%),重点研究独活提取物I中3种有效成分(二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯)在体单向灌流肠吸收特性,考察此3种有效成分在不同吸收部位和不同浓度条件下的小肠吸收情况,并比较独活提取物I和独活提取物II中3种成分在结肠中的吸收。 对照品贮备液的制备 仪器LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津分析仪器公司); SPD-10A紫外检测器(日本岛津分析仪器公司); 1-15K高速冷冻离心机(Sigma公司); N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息研究所); HL-2电子蠕动泵(上海沪西分析仪器厂); ZNHW-III电子节能控温仪(巩义市英峪予华仪器厂)。 药品与试剂二氢欧山芹醇乙酸酯对照品(自制,纯度98.7%);蛇床子素对照品(自制,纯度98.8%);二氢欧山芹醇当归酸酯对照品(中国药品生物制品检定所,纯度99%);独活药材(徐州彭祖中药饮片有限公司);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。 Krebs-Ringer’s灌流液组成:NaCl(133 mmol·L-1),KCl(4.7 mmol·L-1),CaCl2(3.3 mmol·L-1),MgCl2(2.3 mmol·L-1),NaH2PO4(1.8 mmol·L-1),NaHCO3(16.4 mmol·L-1),D-葡萄糖(7.8 mmol·L-1)。 动物SD大鼠,雄性,体重250~300 g,中国药科大学实验动物中心。 独活提取物I和独活提取物II的制备独活提取物I的制备:独活药材粉碎,过20目筛,4倍量95%乙醇提取2 h,反复提取3次,合并提取液,减压回收溶剂,得独活提取物I。独活提取物II的制备:取独活提取物I 10 g,进一步精制纯化得独活提取物II。 色谱条件C18色谱柱(250 mm×4.6 mm ID, 5 μm); 流动相: 甲醇-水(70∶30,v/v), 流速: 0.6 mL·min-1(1~15 min), 1.0 mL·min-1(15~35 min); 进样量: 20 μL; 柱温: 25 ℃; 检测波长: 325 nm。 标准曲线的绘制独活提取物I分析用标准曲线的绘制: 精密称取二氢欧山芹醇乙酸酯对照品1.4 mg, 蛇床子素对照品3.1 mg, 二氢欧山芹醇当归酸酯对照品1.2 mg, 置10 mL量瓶中, 甲醇定容, 即得对照品贮备液(I)。精密量取对照品贮备液(I)适量, 用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液, 精密吸取系列溶液各200 μL, 置于10 mL离心管中, 分别精密加入Krebs-Ringer’s灌流液1.3 mL, 乙醚1.5 mL, 涡旋2 min, 4 000 r·min-1离心10 min, 吸取上层液, 反复操作3次, 合并上层液, 氮气吹干, 精密加入甲醇200 μL, 涡旋1 min, 离心(10 min, 13 500 r·min-1), 取上清液20 μL进行高效液相色谱分析, 分别以3种对照品的质量浓度(C, μg·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归, 得3个标准曲线方程。 独活提取物II分析用标准曲线的绘制: 精密量取二氢欧山芹醇乙酸酯对照品1.4 mg, 蛇床子素对照品3.1 mg, 二氢欧山芹醇当归酸酯标准品1.2 mg, 置10 mL量瓶中, 加入5 mL无水乙醇和5 mL 10%吐温乙醇液溶解, Krebs-Ringer’s灌流液定容至100 mL, 摇匀, 即得对照品贮备液(II)。精密量取对照品贮备液(II)适量,用阴性溶液(取无水乙醇5 mL和10%吐温乙醇液5 mL,Krebs-Ringer’s 灌流液定容至100 mL,混匀,即得)稀释