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盐胁迫下甜瓜转录因子表达的表达变化 土壤盐分是一个全球生态环境问题，是植物生长发育和农业生产的主要因素之一（zhang等人，2011）。甜瓜是我国重要的经济栽培作物。葫芦科中, 甜瓜的耐盐性仅次于南瓜, 但较高的盐分也会对甜瓜栽培造成危害 (Botía等2005) , 如抑制甜瓜生长、影响代谢、降低产量及品质等 (Mendlinger和Fossen 1993; Franco等1997; Carvaja等1998; Mavrogianopoulos等1999; del Amor等2000) 。研究甜瓜耐盐机制对于了解作物耐盐性和盐渍化土壤改良具有重要意义。 甜瓜耐盐性的研究主要集中生理特性方面, 如在盐胁迫下甜瓜的离子浓度、气孔开度、光合能力、抗氧化酶活性等方面 (Mendlinger和Paster- nak 1992; Mavrogianopoulos等1999; del Amor等2000; Rodríguez-López等2000; Sivritepe等2005) 。 利用分子生物学手段来研究甜瓜盐胁迫下的转录调控鲜有报道。转录调控是植物对逆境胁迫产生应答的关键步骤 (Kawaura等2008) , 转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中有重要作用。当植物受到逆境胁迫时, 转录因子会与相应的顺式作用元件结合启动相应基因的转录表达, 调控并减轻逆境胁迫给植物带来的伤害 (刘强等2000) 。研究盐胁迫下植物转录因子表达的特性和规律对揭示植物耐盐机理具有重要意义。 转录组研究发现大量转录因子在盐胁迫条件下表达发生变化。利用微阵列技术分析盐胁迫条件下拟南芥转录组的变化, 发现有289个转录因子受盐胁迫诱导上调表达, 139个转录因子的表达被抑制 (Jiang和Deyholos 2006) 。同样, 在苜蓿中发现171个基因被盐胁迫诱导而上调表达, 其中20% 是转录因子 (Gruber等2009) 。 本研究利用新一代高通量测序手段——转录组测序 (RNA-Seq) 技术, 通过转录组分析来研究不同品种甜瓜叶片中盐胁迫响应转录因子表达特性, 以期更好地理解甜瓜对盐胁迫响应的分子机制, 增加对作物耐盐机理的认识, 并为培育耐盐品种提供参考。 材料和方法 1 试验材料和材料 本试验采用2种不同地区的甜瓜 (Cucumis melo L.) 品种‘冰雪脆’ (‘BXC’, 产地济南, 光皮) 和 ‘玉露’ (‘YL’, 产地台湾, 网纹) 为试验材料。 2 基质处理与盐析 本试验于上海交通大学农业与生物学院现代农业工程训练中心玻璃温室区进行。选取籽粒饱满、大小一致的种子, 浸种催芽后播种于盛有混合基质 (蛭石:珍珠岩=1:1) 的128孔穴盘中。萌发后每隔2 d浇1/2 “花无缺”营养液 (N:P:K=20:20:20) (上海永通化工有限公司) , 培养基质含水量维持在相对湿度75%左右。待幼苗长到两叶一心时, 移栽到20 L的PVC桶中 (每桶种1株) , 所用混合基质为草炭:蛭石:珍珠岩:有机肥=4:4:1:1, 测定基质的EC值为1.0, p H为7.03。温室条件为日温24~28 ℃, 夜温18 ℃; 光周期14 h·d-1(光照强度大于87.5 μmol·m-2·s-1) 。 以去离子水为对照, 用300 mmol·L-1浓度的Na Cl溶液进行处理。为避免盐冲击效应, 采用每天递增75 mmol·L-1盐浓度方式处理。达终浓度后每隔2 d浇足量终浓度盐溶液, 以冲洗基质中残留盐分, 保证基质盐浓度在最小的范围内波动。期间视需要同时浇以“花无缺”营养液。每个处理随机取样3株, 重复3次。在达到终浓度后第7天时进行叶绿素荧光指标的测定和分析, 且取甜瓜叶片经液氮处理并于–80 ℃下保存备用。 3 叶片光化学活性测定 将各处理植株充分暗适应30 min以上, 用FMS-2型便携式荧光仪 (英国Hansatech公司) 在室温下测定每株叶片暗适应下的光系统II最大光化学效率 (Fv/Fm) 、初始荧光 (F0) 和光化学量子效率 (ФPSII) 。每个指标测定重复6次, 取平均值。利用Microsoft Excel 2007整理测定数据, 采用Sigma Plot 11.0作图, 方差分析用SAS 9.0处理。 4 rna提取方法 按Trizol试剂盒 (Invitrogen公司, 美国) 说明书提取总RNA, 并用RNeasy Mini试剂盒 (Qiagen公司, 荷兰) 纯化。用Nano Drop-1000分光光度计测定所抽提RNA样品的A260、A280值, 计算样品浓度, 并用变性琼脂糖凝胶电泳定性检测所提取RNA的质量。每个处理取3个生物学重复的RNA样品混合为50 μL, 用于RNA-Seq转录组测序。 5 转录组测