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组学技术在细胞代谢研究中的应用 近年来，各种组学技术，包括重组、蛋白质组、代谢组和代谢体积组，在阐明细胞生理活动规律方面发挥了越来越重要的作用。通过组学技术,可以系统评价细胞表型,并根据评价结果进一步设计、修饰和重构细胞,提升代谢工程的合理性和有效性,这就是在后基因组时代所强调采取组学技术指导的代谢工程研究方法,称之为“系统代谢工程”。 在各种组学技术中,转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术。细胞的功能是从基因的表达开始的,转录组是指某一时间细胞内所有基因转录而来的RNA总称。通过分析转录组,可高通量地获得基因表达的RNA水平有关信息,可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。据此我们可以高通量表征细胞生理活动规律,确定细胞代谢特性,并进而对细胞进行修饰改造。本文介绍了转录组学主要技术平台及其原理,总结和评述了转录组学在代谢工程中的应用及进展。 1 y基因表达系列分析技术及施工流程 为了高通量并行分析基因的表达情况,各种转录组技术平台得到迅速发展,主要包括:基因芯片技术(Microarray)、基因表达系列分析技术(Serial analysis of gene expression,SAGE)、大规模平行测序技术(Massively parallel signature sequencing,MPSS)以及最新提出的RNA测序技术(RNA sequencing,RNA-seq),这些技术的工作流程如图1所示。 1.1 基因芯片技术 在转录组研究中应用最早及最广泛的为基因芯片技术,首先从待检测样品中提取RNA,并利用荧光标记的核苷酸将其反转录成c DNA,经过标记的核苷酸序列可与基因芯片特定位点上的探针杂交,经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。基因芯片技术已成为一项非常稳定可信的实验技术,目前公布的大量转录组数据主要是利用基因芯片技术产生的。 为了促进基因芯片数据的交流和比较,2001年基因芯片表达数据协会(Microarray gene expression data society)提出了基因芯片试验的标准方案,即MIAME方案(Minimal information about a microarray experiment);由美国食品药物管理局(US food and drug administration,FDA)领导实施的基因芯片质量控制联盟(MAQC)发表的报告显示在不同实验室之间基因芯片技术平台内部的数据具有高度的一致性和重现性。基因芯片是最早开发出来的高通量转录组检测技术,且成本适中,其对较高表达的基因检测比较准确,数据分析软件较多,整个方法较为成熟,主要缺点是对低表达基因检测敏感度不够,前期工作基础要求较高,而且很难检测出融合基因转录、多顺反子转录等异常转录产物。 1.2 sage和mpss的基本原理 SAGE技术是一种基于测序技术、开放式的、快速高效的分析细胞基因表达状态的方法,该技术不需任何基因序列的信息,能够全局性地检测所有基因的表达水平,除了具有显示基因差异表达谱的作用外,还对于那些未知基因特别是那些低拷贝基因的发现起到了巨大的推动作用。SAGE技术首先从待检测样品中提取RNA,并用生物素荧光标记的核苷酸将其反转录成c DNA,随后用一种被称为锚定酶的限制性内切酶(Anchoring enzyme)切割双链c DNA,将回收得到的c DNA片段与不同的接头连接,再用标签酶酶切处理后得到SAGE标签,连接SAGE标签形成标签二聚体并进行PCR扩增,最后锚定酶切除接头序列以形成标签二聚体的多聚体,对其测序可得转录组。 MPSS技术是对SAGE技术的改进,但其原理都是基于短标签测序(Tag-based sequencing)的方法。MPSS技术可获得更长的短标签,因而精度更高;此外,MPSS技术特有的微球荧光测序可直接高通量读出序列,简化了测序过程。MPSS技术首先从待检测样品提取RNA并反转录为c DNA,克隆至带有不同adaptor的载体文库中,随后PCR扩增带有不同adaptor的c DNA片段,在T4 DNA聚合酶和d GTP的作用下使其转换为单链文库,最后通过杂交将其结合在带有Anti-adaptor的微载体上进行测序。 SAGE技术和MPSS技术都需要大量的测序工作,但高通量基因测序仪的迅速发展缓解了这一问题,有力推动了它们的推广与应用。但是这些技术的难度较大,而且涉及酶切、PCR扩增、克隆等可能会产生碱基偏向性的操作步骤,从而影响转录本的正确识别。Illumina公司于2007年在MPSS技术的基础上推出新一代测序仪Illumina/Solexa Genome Analyzer,正迅速得到普及。 1.3 rna-seq技术的基本原理 新一代高通量基因组测序仪的迅速发展(Sol