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美拉萨嗪对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎模型h1、h17和reg亚群的影响 溃疡性胃炎（iu）是一种常见的炎症性肠病。这是一种病因不明、以胃肠道慢性非特异性炎症为主要原因的疾病。近年来，它已成为一种常见的神经系统疾病，其主要临床表现为腹痛和腹泻。关于其病因目前大多数研究认为与环境、遗传、感染及免疫学因素相关, 而免疫学因素被认为与UC的发生发展密切相关, CD4+T细胞亚群在UC发病中尤为重要。本研究通过检测葡聚糖硫酸钠 (dextran sulfate sodium, DSS) 诱导的小鼠UC模型结肠组织及外周血单个核细胞中CD4+T细胞胞内IL-17、IFN-γ和核转录因子Foxp3的表达, 观察UC小鼠模型CD4+T细胞亚群的改变, 并研究美沙拉嗪 (mesalazine, MSLZ) 预治疗对各CD4+T细胞亚群的影响, 探讨UC可能的发病机制及美沙拉嗪治疗UC的免疫学机制。 材料和方法 1 实验动物与试剂 无病原环境出生的C57BL/6小鼠 (6~8周龄) (购自广东省实验动物中心) 。DSS分子量为35 000~40 000, 购自MP。抗小鼠CD3-PE-Cy7 (Bio Legend) ;抗小鼠CD4-FITC、抗小鼠CD272-APC、抗小鼠IL-17-PE、抗小鼠IFN-γPer CP-Cy5.5和抗小鼠Foxp3-PE-Cy5.5均购自e Bioscience。流式细胞仪为BD产品。破膜剂为杭州联科生物公司产品。美沙拉嗪为葵花药业产品。大便隐血试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。胶原酶II为Sigma产品。 2 u3000小鼠 参阅文献制作UC模型, 取小鼠16只, 随机分为对照组 (Con组) 和实验组 (DSS组) , 每组8只小鼠, 2组小鼠性别比、周龄、健康状况及体重均无统计学差异, 可进行后续实验。Con组小鼠给予自来水自由饮用, DSS组给予5%DSS (用水溶解) 自由饮用, 各组小鼠实验时间为7 d, 第8天处死小鼠。造模后每天观察小鼠活动情况、毛色变化、大便性状、颜色及有无出血等情况。 3 美拉嗪颗粒的提取 取小鼠8只, 给予5%DSS造模, 在造模的同时给予美沙拉嗪治疗, 作为美沙拉嗪治疗组 (MSLZ组) , 每天用美沙拉嗪 (缓释颗粒;商品名:艾迪莎) 灌胃治疗, 按实验动物与人体表面积比等效剂量换算比率, 将每天剂量折算成小鼠等效剂量作为中剂量用量[小鼠用量 (g/kg) =人每天口服药量 (g) ×0.0026/0.02kg], 时间为7 d, 同样每天观察小鼠活动情况、毛色变化、大便性状、颜色及有无出血等情况。 4 外周血单个核细胞pb-mc分离 第8天取小鼠内眦静脉血, 用EDTA-K2抗凝, 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PB-MC) , 对细胞进行活性检测和计数后重悬于含2%胎牛血清的PBS中, 备用。 5 dtt法 小鼠结肠黏膜固有层单个核细胞 (lamina propria mononuclear cells, LPMC) 的分离参阅文献方法进行。取小鼠肛门至盲肠末端结肠, 纵切, 去内容物, 将组织剪碎足够小, 于含EDTA和二硫苏糖醇 (dithi othreitol, DTT) 的PBS液中孵育30 min, 离心, 重复2次。将组织置于酶液 (胶原酶II含量为0.5 g/L的RPMI-1640) 中, 37℃水浴消化30 min, 离心, 过滤, 收集滤液, 回收滤渣重复消化1次, 收集所有滤液加入到含有小鼠淋巴细胞分离液的离心管中离心, 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞, 2%FBS-PBS洗涤, 对细胞进行活性检测和计数后重悬于含2%胎牛血清的PBS中, 备用。 6 荧光定量pcr检测cd3-pe、cd3-cy7/cd8-percp-cy5.5和ifn--percp-cy5.5的表达 将分离的单个核细胞分成4份, 每份细胞数为1×106, 加PMA/Iono Mixture体外37℃、5%CO2培养箱孵育4 h, 最后2 h加BFA孵育, 洗涤, 1份加同型对照抗体, 其余3份分别加入CD3-PE-Cy7/CD4-FITC混合抗体和CD3-PE-Cy7/CD8-PE混合抗体, 避光孵育25 min, PBS洗涤, 加破膜剂A液100μL避光孵育15 min, PBS洗涤, 加破膜剂B液100μL, 同时分别加入IL-17-PE/IFN-γ-Per Cp-Cy5.5混合抗体、Foxp3-PE-Cy5.5和IFN-γ-Per Cp-Cy5.5, 避光孵育25min, 洗涤, 固定, 上流式细胞仪分析。 7 植物种bf 0