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浅谈宏转录组学在遗传调控中的应用 自然界中的微生物多样性非常复杂。大多数微生物无法通过传统的纯培养方法在培养基中的培养和分离。研究显示,只有1%～5%的微生物可以在实验室实现纯培养。因此,在过去的300多年中,大多数微生物不能通过传统的、已经设计好的实验方案进行研究。随着分子生态学方法的建立,科学家们对环境微生物的整体情况有了较深刻的了解。最初,研究人员采用基于16S/18S rRNA/rDNA的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和克隆文库的方法对反刍动物肠道微生物群落的变化情况进行监控,随后荧光原位杂交(Fluorescent in situ hybridization,FISH)和限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)等技术的建立和应用,使人们对微生物群落有了更加深入的了解。20世纪兴起的宏基因组学(metagenomics)通过大规模的测序技术,能够直接得到某一环境条件下微生物群落的整体结构信息,这在很大程度上解决了大部分微生物因不能分离培养而难于研究的问题,避免了其他固有技术(如PCR)应用中易出现的实验偏差,同时也免去了一些费时耗力的实验步骤比如文库构建。但是,该技术仍无法对微生物群落结构及代谢、功能间的关系进行剖析和监测,特别是无法明确微生物适应环境变化而做出的响应。 宏转录组学(meta-transcriptomics)是在宏基因组学之后兴起的一门新学科,研究特定环境、特定时期群体细胞在某功能状态下转录的所有RNA(包括mRNA和非编码RNA)的类型及拷贝数。这种技术不但具有宏基因组技术的的全部优点,而且能将特定条件下的生物群落及其功能联系到一起,对群体整体进行各种相关功能的研究。 新一代测序方法的产生直接扩大了宏基因组研究的数量和范围,并且推动了宏转录组学的建立和发展。454焦磷酸测序法是新一代的测序技术,它能够对DNA或者cDNA直接进行测序,省去了克隆的步骤,增加了测序产量,而且降低了每个测序碱基的成本。Leininger等第一个使用454测序技术对一个复杂微生物群落的宏转录组进行研究发现与土壤中的其他细菌相比较,古菌胺氧化关键酶(amoA)的转录本能够保持相当高的丰度,这体现了古菌在土壤胺氧化微生物中的数量优势。该转录组学研究所获得的25 Mbp的序列由Urich等做了进一步的分析。2008年,Friaz-Lopez等通过该测序法获得了50 Mbp的测序长度。第二代GS-FLX测序技术具有分析结果准确、快速、高灵敏度和高自动化的特点,在技术的成熟性和性能方面也均远远超越了第一代,用此技术Gilbert获得了300 Mb的序列数据。最近报道的454 FLX Titanium平台,其测序的平均长度大约为400 bp,并且可以预测,未来其读取长度可以和那些传统测序技术相媲美。 随着大规模测序工作的迅速开展,出现了各种生物信息学数据库,应用于大规模微生物的基因组序列分析。这些数据库之间联系密切,并借助于网络形成了复合的、开放型的多功能数据库系统。这些新型数据库系统还整合了多种数据分析软件,为使用者提供了方便。另外,大量基因注释工作的完成极大丰富了数据的信息量。可以预见,当基因组测序及注释工作基本完成以后,积累的大量数据将使生物信息学在人类基因组研究中的重要性更加突出,为宏转录组和宏基因组技术的发展,提供有利的新途径。 1 提取纳米na 宏转录组学研究方法通常含有五个步骤(图1),其中群体RNA的处理及数据的比较分析是较为关键的两步。由于RNA的稳定性要比DNA差的多,有些转录组样品的放置时间不能超过一分钟,因此必须采取一些有效的措施以防止RNA的降解,比如立即速冻或者放置于RNA储存液当中,并尽快完成反转录。另外,在一个细菌细胞的总RNA中,mRNA仅仅占1%～5%,这就需要在提取之后进行mRNA的富集。虽然不经过富集的mRNA样品也能够通过焦磷酸测序进行群落结构的分析,但如果主要的目的是研究群落的转录谱,如此的测序量便是一种浪费。现在已有可用于mRNA富集的商业化试剂盒。比如,使用Ambion的MICROBExpress试剂盒,其去除rRNA后的样品经反转录产生的cDNA中rRNA的数据比例20%,或低于0.08%。另一个重要的步骤是数据分析。数据库的发展是宏转录组分析的重要影响因素,常用的宏基因组、宏转录组和宏蛋白质组研究的数据库和软件列于表1。 2 资源和优势 2.1 实验结果的比较 在过去几十年中,大量的转录组测序已经完成,它们回答了药物学与生物学中许多关键性的问题,并且为解释某些抗冲击表型,比如抗紫外线、抗热击等相关基因的表达提供了有价值的依据。这些转录