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牛体外受精技术的研究进展 动物繁殖技术是生物技术的一个重要分支。繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到20世纪70年代胚胎移植技术的应用，似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。牛的繁殖技术在过去的50年里取得了显著进展，这是一个以人工授精起始的连续过程。随着体外受精、精子分离和核移植（克隆）等技术的发展，这些连续性的繁殖技术将是目前和未来提高生产力的强有力手段。 1 其他方面的研究 自1982年以来，家畜体外受精技术，尤其是牛体外受精(IVF)技术的发展十分迅速，仅仅10年时间，就已从理论上、方法上得到充分的完善和发展，成为动物胚胎工程及细胞工程领域内的一个基本和重要的研究分支，并从20世纪80年代末就开始进入应用阶段。 牛IVF技术的主要环节包括：(1)屠宰牛卵巢卵母细胞的采集、保存和运输。(2)卵巢卵母细胞的采集：利用注射器吸取或其他方法，将未成熟的卵母细胞从可见卵泡中取出，然后在显微镜下选择卵丘细胞层完整的正常卵母细胞进行体外成熟培养。(3)卵母细胞的体外成熟培养(IVM)：将处于生发泡期的未成熟卵在添加激素或血清的培养基内培养至成熟阶段，进行体外受精。(4)精子的体外获能处理：体外条件下利用化学药物(IA、咖啡因及肝素等)使精子达到获能状态。(5)受精处理：把培养成熟的卵子和获能处理好的精子放在一起培养，使其在体外条件下完成受精过程。(6)受精卵的体外发育培养(IVC)：通过一系列培养条件的探索，使受精卵发育到桑椹胚和囊胚阶段。(7)发育胚胎的冷冻保存。(8)胚胎的质量评定。(9)胚胎移植：这是体外受精技术的最终目的。(10)受体牛的妊娠诊断和管理。 由于牛IVF技术在养牛业上的巨大应用潜力，世界上许多发达国家均投入大量的人力和财力进行了牛IVF胚的开发性研究，从而促使牛IVF技术从实验研究开始走向商品化应用。目前世界上在这项技术上投入力量最大的有日本、美国、英国，中国和丹麦也做了大量工作。在20世纪90年代中叶，美国、加拿大和欧洲（主要是德国、意大利、法国和荷兰）就出现了IVF商业化应用的实验室。几年后，在南美洲（如巴西和阿根廷）和大洋州（如澳大利亚和新西兰）也建立了这样的实验室。采用超声波扫描经阴道活体采集卵母细胞技术（OPU）的应用加速了IVF在活体家畜上的应用。目前，对供体牛采卵有2种方法：其一是对供体牛不做任何处理，每周采卵1次；其二是对供体牛进行激素处理，使之有更多的中、小卵泡出现后再进行采卵。经激素处理供体牛的效果明显优于不处理。IVF商业化应用的最初目的是从母畜体内获得成活的胚胎而不使用传统技术来受孕。目前，IVF是胚胎移植（ET）程序的一部分。它主要应用于那些发情处理较为困难、不能生产可移植胚胎的母畜或者是在繁殖期间出现异常的母畜（如卵巢粘连或输卵管阻塞）。IVF也应用于由于年龄、突发状况、疾病等造成的繁殖障碍的母畜，以及在妊娠期前3个月内的怀孕小母牛或成年母牛。IVF还应用于正常繁殖周期的小母牛和成年母牛以及发情期前的犊牛。商业性机构和研究机构已将OPU-IVF技术应用于不同类型的母畜（包括初情期前的犊牛、小母牛、成年母牛），不同年龄的母畜（包括初情期前、初情期后和适龄母牛），不同品种，不同繁殖周期（间期、妊娠期和分娩后），不同采卵频率（1周1次、1周2次、1个月2次），不同激素处理（FSH,nBST）和不同的IVF过程（BRL细胞共培养，化学限定培养液，血清），并获得不同程度的成功。 IVF技术可提高精子使用效率。在精子细胞内注射（ICSI）技术未广泛应用于牛IVF商业化生产之前，IVF技术就为使用相对少量精子生产成活胚胎提供了条件。这使精子利用率更高，并为精子性别分离提供重要条件。 从1992年到2000年，使用的胚胎培养液从TCM-199培养液到与BRL细胞共培养的MenezoB2培养液，其中加入10%胎牛血清（FCS）来培养胚胎。从2001年开始，培养系统改为SOF的柠檬酸盐半限制性培养液（添加5%FCS）从而避免或减少出现犊牛体型过大综合征的危险。在SOF系统中培养的第6.5 d才观察培养皿内胚胎的发育状况，培养箱内的条件是5%的O2、6%的CO2、和89%的N2，并保持较高湿度。由于胚胎体外冷冻的不良效果，通常采用鲜胚进行移植。可能是由于培养条件或受精程序造成胚胎对外界条件较为敏感。 IVF技术的应用效果受很多因素的影响，其中主要因素是供体的状态，卵母细胞的质量和将胚胎从合子培养到囊胚期的技术。尽管IVF技术从应用到动物育种上开始至今，这项技术已有较大发展，但仍有许多改进之处，包括提高卵母细胞和胚胎的活性，减少培养系统对犊牛出生大小的影响，提高卵母细胞的质量，成功使用性别分离后的精子，ICSI技术以及腔前卵泡的培养，这些方面将是最近及未来研究的主要方向。 2 体外法性别鉴定与性别分离