基于马氏体的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因诊断.docxVIP

基于马氏体的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因诊断 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（6gpd）是最常见的人类酶遗传因素。在高发区G6PD缺乏症是引起新生儿高胆红素血症最主要的原因, 严重者可因脑神经系统损害导致不可逆的智能和身体残疾, 因此联合国卫生组织把该病列入6种主要应该预防和控制的遗传病之一。 G6PD缺乏症为性X连锁不完全显性遗传, 疾病的临床症状通常见于半合子的男性, 因此为预防G6PD缺乏症发生的新生儿残疾, 在孕期予携带者女性进行干预, 可有效的降低残疾儿的发生率。既往的研究由于女性杂合子酶活性有较大的表现度, 生化检测方法常常不能检出, 这使得很多患儿在没能得到有效的保护下发病, 随着分子检测技术发展, 使我们从G6PD分子水平来分析其生化表型成为可能, 为我们了解G6PD缺乏的分子病理、G6PD缺陷人群干预措施的制定及临床遗传咨询等提供依据。 对象与方法 1.研究对象: (1) 随机取2002年10月至2002年12月在柳州市妇幼保健院进行新生儿筛查经G6PD/6PGD比值法确诊的G6PD缺陷男性患者100例及其母亲100例血样, 进行高铁血红蛋白还原实验 (MHb-RT) 、以验证MHb-RT法对G6PD缺陷男性半合子及女性杂合子的检出率。 (2) 取2002年12月到2003年8月在柳州市妇幼保健院接受婚检 (整群抽取) 的4704个不相关的参与者, 其中男2368例 (年龄29.55±5.03岁) 、女2336例 (年龄27.55±3.89岁) 。这组人群作为群体基因型及表型研究的对象。以机械抽样的方法随机抽取大样本中经生化筛查阴性的样本129例为对照组, 其中男性64例 (年龄29.61±4.53岁) , 女性65例 (年龄26.27±4.23岁) 。 2.实验室方法:表型分析采用传统的高铁血红蛋白还原试验 (MHb-RT)(以MHb-RT75%为阴性;MHb-RT≤75%为阳性) 进行初筛, 然后用G6PD/6PGD比值法(比值1.5为阴性;比值≤1.5为阳性) 进行定量检测G6PD缺乏症的发生率, 然后我们把所有经过高铁血红蛋白还原实验检测为阳性的样品用标准酚/氯仿方法抽提基因组DNA, 通过多重引物延伸/变性高效液相色谱法 (PE/DHPLC) 技术进行基因型分析, PE/DHPLC技术能同时检测10种东南亚地区常见G6PD基因突变类型 (95 AG, 392 GT, 487 GA, 493 AG, 592 CT, 871 GA, 1024CT, 1360 CT, 1376 GT, 1388 GA) 和一种多态性位点 (1311 CT) 。为了检测是否存在新突变或其他突变类型, 对PE/DHPLC未检测出的样本对人类G6PD基因的12个外显子和外显子-内含子结合区进行DNA直接测序。此外, 用PE/DHPLC检测129例对照组其G6PD突变的情况, 在65例女性样品中发现2例常见突变类型 (1376 GT和1388 GA) , 为了验证这部分女性样品是否还存在其他G6PD基因突变类型, 我们同时对余63例女性样本进行DNA测序。为了确定在正常对照或在女性中1311T复合内含子11-93C出现的频率, 使用双重突变特异性扩增系统 (ARMS) 来进行该两个多态性位点的单倍型分析。 3.实验设备:PE/DHPLC检测采用美国ABI公司9700PCR循环仪及Transgenomic公司WAVE?2100型核苷酸片段分析系统完成。DNA测序使用美国ABI公司Prism DN377型测序仪。对所有标本分析红细胞参数 (日本CIS公司F820型血球分析系统) 。 4.统计学分析:χ2检验用于分析正常对照组与G6PD缺乏人群1311CT突变频率是否存在差异分析;单样本完全随机分析 (ANOVA) 分别研究半合子、杂合子、突变纯合子不同基因型之间,t检验用于不同基因型及其复合1311T多态、正常对照与复合1311T多态之间是否存在差异;半合子、杂合子、突变纯合子不同基因型之间以及与正常对照组之间表型统计学分析;用SPSS 13.0软件进行分析。 结果 1.高铁血红蛋白还原率在G6PD缺乏样本检出情况:100例G6PD缺乏儿高铁血红蛋白还原率35%占97% (97/100) , 35~40%占3% (3/100) , 100例理论缺乏者母亲91% (91/100) MHb-RT≤75%, 69% (69/100) G6PD/6PGD比值 ≤1.5, 比值法阳性的样本全部有MHb-RT阳性。 2.群体生化筛查情况:经MHb-RT对4704份血样本筛查, 有441个 (9.83%) ≤75%为初筛阳性可疑缺乏, 其中男205例, 检出率8.66% (205/2368) , 女236例, 检出率10.1% (236/23