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荧光定量r-pcr方法在登革病毒检测中的应用 病毒登甲（dap）是一种急性昆虫传播感染的病原体，可导致登甲热（df）、登甲出血热（dhf）和登甲休克综合征（dds）。dhf和dds的死亡率很高。根据邓甲病毒的抗原性，可分为四种类型（d1.4）。在过去的40年里,登革热流行范围已遍及整个热带和亚热带地区,在除欧洲之外的所有大陆都有流行,已成为流行地区普遍关注的公共卫生问题。在我国,以往登革热主要在华南地区和台湾省流行,近几年随着国际交往的日益频繁,登革热在我国的流行范围不断扩大,流行频度也有所上升。2004年7-10月浙江省慈溪市突然发生疑似登革热暴发疫情,共报告登革热病例113例;同年10月,杭州市某医院接收一位曾在登革热流行区马尔代夫归国的登革热疑似病例,但经ELISA法检测登革病毒IgM与IgG抗体均为阴性。为迅速确定病原,我们建立了登革病毒1、2型的TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法,对上述病因进行了快速、正确的实验室诊断,收到了很好效果,现将结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 疑似病例标本上传 登革病毒标准毒株1、2型由广东省疾病预防控制中心(CDC)馈赠,浙江省慈溪市登革热暴发疫情中疑似病例的血清标本及杭州市某医院采集的疑似病例血清标本由当地CDC送检。 1.2 同源性较好的ns5基因和2型c基因保守区的设计和改造 从GenBank上下载几十株不同年份和地区分离的登革病毒1、2型核苷酸序列,用Bioedit软件进行同源性比较找到保守区,参考Johnny等在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,略作改动,碱基序列见表1。引物和探针均委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.3 tcid50反应管的制备 登革标准毒株采用C3 36细胞进行病毒效价滴定后(106TCID50ml)作为参考株,将其稀释至1000、100、10、1、0.1、0.01 TCID50反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit,按试剂盒说明书提取。 1.4 引物与探针配比的确定 为防止TaqMan荧光定量RT-PCR反应混合物中由于引物与探针之间的浓度不当而引起非特异性竞争抑制,选择引物与探针的最佳浓度配比。试验在相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。 1.4.2 浓度为mg2的优化 Mg2+的浓度高低对Taq酶的活性与扩增的特异性密切相关,用相同浓度的登革病毒核酸作为模板,对Mg2+浓度进行优化。 1.4.3 3m温度优化 在同一浓度阳性核酸为模板条件下,采用荧光定量PCR仪上的温度梯度功能,在Tm值(45～65℃)下进行检测,选择最佳Tm温度。 1.5 pcr引物、taq酶和逆转录酶混合物depc的制备 采用Roche公司的RT-PCR试剂盒进行,反应体系为20μl。其中5×RT-PCR缓冲液4μl,dNTP混合物(10 mmol L)1.6μl,DTT(100 mmol L)1.0μl,RNase抑制剂(5 Uμl)0.4μl,20μmol L上游引物与下游引物各0.5μl,Taq酶和逆转录酶混合物(5 Uμl)0.4μl,模板RNA 10μl,最后用DEPC水补足至20μl。反应条件为50℃30 min,94℃2 min进行逆转录,然后94℃30 s,55℃30 s,68℃1 min进行扩增,35个循环后转入68℃7 min,取8μl产物进行电泳判断有无106 bp(登革1型)和80 bp(登革2型)的特异性条带。 1.6 taqman荧光定量rt-pcr检测 提取流行性乙型脑炎(乙脑)病毒、肾综合征出血热(HFRS)病毒以及登革病毒3、4型等核酸,用建立的登革病毒1、2型TaqMan荧光定量RT-PCR系统进行检测,验证检测体系的特异性。同时对已标定TCID50的登革病毒稀释后分别提取RNA,平行进行TaqMan荧光定量RT-PCR与RT-PCR反应,比较其灵敏度。此外,对每一个浓度的病毒稀释液做5次重复检测,得到的Ct值采用Stata 8.0软件计算标准差,验证检测体系的稳定性。 2 结果 2.1 pcr检测taq酶的表达 RT-PCR试剂盒由Roche公司提供,反应体系为25μl。优化后各反应物的终浓度为:0.2 mmol L dNTP混合物(each)、7.5 mmol L MgCl2、0.5μl Taq酶和逆转录酶混合物(5 Uμl)、10μl模板RNA、矩阵法优选后1、2型的引物和探针最佳浓度分别为0.8μmol L的引物浓度与0.48μmol L的探针浓度及0.6μmol L的引物浓度与0.4μmol L的探针浓度,最后用DEPC水补至25μl。用MJ Researc