基于质粒psb166的葡萄芪合成酶基因克隆与表达分析.docxVIP

基于质粒psb166的葡萄芪合成酶基因克隆与表达分析 ucinus不诚实地病害了世界葡萄糖生产。现在，欧洲盆栽的优良品种、新鲜食品和无核品种对葡萄皮的抗性较低，且该生产的抗病性主要基于化肥。但是化学防治不仅增加了生产成本,造成环境污染,还会降低葡萄及其加工产品的品质。此外,各种环境胁迫如干旱、寒冷和高盐等因子,也会造成葡萄品质和产量的下降。利用基因工程手段改良优质欧洲葡萄品种及鲜食、无核品种获得转基因的抗白粉病、抗逆品种是解决上述问题的有效途径之一。本课题组通过mRNA差显技术,已从中国野生葡萄中高抗白粉病的华东葡萄白河35-1中分离出抗白粉病、抗逆基因的cDNA片段,结合RACE(Rapid amplification of cDNA Ends)技术获得了抗白粉病和抗逆基因的2个cDNA全长序列:芪合成酶基因1 185 bp(Stilbene synthase gene,STS)、醛脱氢酶基因1 622 bp(Aldehyde dehydrogenase gene,ALDH),从而为通过基因工程培育抗病抗逆葡萄新品种提供葡萄基因资源。 本研究的目的是构建葡萄芪合成酶基因和醛脱氢酶基因植物表达载体pWR-STS和pWR-ALDH,并用改进冻融法将其导入根癌农杆菌GV3101,以期通过农杆菌介导法,获得葡萄抗白粉病和抗逆的转基因植株,为定向改良品种抗性提供新途径。 1 材料和方法 1.1 菌株和质粒 克隆载体pGEM-T Easy Vector为Promega公司产品。质粒pCAMBIA1303、根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefacious)GV3101由美国农业部西弗吉尼亚州Apparadian果树实验站刘宗让博士惠赠,质粒pSB166由西北农林科技大学马锋旺教授惠赠,大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α由西北农林科技大学果树种质资源与生物技术育种实验室保存。 1.2 引物、试剂与质粒 限制性内切酶、DNA Ligation Kit、Wind Range Ladder Marker、λDNA/HindⅢ Marker、DL2000Marker 购自大连宝生物工程有限公司,PCR引物由大连宝生物工程有限公司合成,质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、Marker Ⅳ购自北京天为时代,gentamycin(Gent),kanamycin(Kan),ampicillin(Amp),X-Gal/IPTG为Sigma公司产品。 1.3 aldh-材料的pcr扩增 根据本课题组已获得的抗白粉病基因STS、抗逆基因ALDH序列,设计合成2对特异引物:STS-F5′端序列为GCG GAT CCA TGG CTT CAG TTG AGG AAA T,STS-R3′端序列为GCC TCG AGT TAA TTT GTA ACC ATA GG;ALDH-F5′端序列为TAG GAT CCA TGG CGG CTA GGA TCT CC,ALDH-R3′端序列为TAC CCG GGT CAC AGC CAA GCT GGA TTC C,并引入限制性酶切位点BamHⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/SmaⅠ及保护碱基,以华东葡萄白河35-1接种病原菌诱导后第7天提取总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(25μL)为10×PCR Buffer2.5μL+dNTPs0.1mmol/L+STS-F (ALDH-F)1.5μL+STS-R (ALDH-R)1.5μL+TaqDNA Polymerase1.0U+cDNA20ng+ddH2O16.25μL。循环参数:94 ℃ 5min;94 ℃ 30s,65 ℃ 30s,72 ℃ 2min;循环35次,72℃延伸5min。 1.4 重组质粒bamh/xho/sma酶切鉴定 PCR产物与pGEM-T Easy Vector经T4DNA连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。用含100μg/mL Amp的X-Gal/IPTG/LB平板筛选,小量提取阳性重组质粒DNA,分别用BamHⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/SmaⅠ进行酶切鉴定。酶切反应体系(20μL)为pGEM-T-STS10.0μL+10×K Buffer2.0μL+BamHⅠ/XhoⅠ各1.0μL+ddH2O9.0μL,37℃水浴1h;pGEM-T-ALDH10.0μL+10×T Buffer1.0μL+0.1% BSA1.0μL+BamHⅠ/SmaⅠ各1.0μL+ddH2O9.0μL,30℃水浴1h。对阳性重组质粒进行测序(由大连宝生物工程有限公司完成),用BLAST程序进行核苷酸序列同源性比对。 1.5 pcamba基因序列的纯化 应用Vector NTI suite9.0软件对质粒pCAMBIA13