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基于金纳米粒子壳聚糖sio 由于其高度寄生虫活性，有机磷农药广泛应用于工农业生产中。随着长期使用杀虫剂的使用，残余农药问题已成为影响人类健康和环境安全的主要问题。有机磷农药可以与乙酰胆碱酯酶（ach）的活性中心丝氨酸酪氨酸酶结合，抑制ach的活动，失去乙酰胆碱的水解能力，导致乙酰胆碱体积小、循环不良、胆碱群落等。加强对农产品中有机磷农药残留的检测对确保人类健康具有深远意义。有机磷农药的一些传统方法，如液相色谱法、液相色谱法和质谱法，已经被广泛应用于各种检测技术的磷农药检测。然而，这些方法所需的设备价格昂贵，测量时间长，成本高，需要专业技术人员。环境是不允许快速检测的。采用ache抑制生物传感器，以酶活力作为定量检测有机磷农药的指标，为检测有机磷农药提供快速、灵敏的方法。 在构建电化学生物传感器的过程中, 将酶固定于工作电极表面的方法有吸附法、 包埋法、 共价键合法、 交联法及电聚合法等, 因此最大程度保持酶的活性是关键问题. 溶胶-凝胶(Sol-gel)法可以很好地保持蛋白质表面微观结构的整体性, 对组分的活性和稳定性损伤较小, 因此能为生物分子如细胞、 酶、 蛋白质、 抗原及抗体等的固定提供良好的载体条件.由于金纳米粒子(AuNPs)具有比表面积大、 表面自由能高和吸附能力强等优点, 因而酶在AuNPs上固定较牢, 不易从酶膜中渗漏; 另外, AuNPs具有很好的生物相容性和高导电性, 可在酶的氧化还原中心与电极之间传递电子, 因此在电化学分析中备受关注. 本文用AuNPs/壳聚糖-SiO2杂化的Sol-gel作为复合固酶基质, 将AChE固定于玻碳电极(GCE)表面, 制备了检测有机磷农药的电流型生物传感器, 该传感器的原理如图1所示. 将AChE固定于工作电极表面, 其与底物氯化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine chloride, ATCl)反应生成硫代胆碱(Thiocholine), 硫代胆碱具有电化学活性, 能产生1个不可逆的氧化峰, AChE的活性会受到有机磷农药抑制, 其被抑制程度可通过测定硫代胆碱产生的氧化电流来监测, 从而定量检测有机磷农药. 通过优化底物浓度、 AuNPs用量、 酶负载浓度以及有机磷农药抑制时间确定了该反应体系的最佳条件. 实验结果表明, 该传感器具有良好的重现性和稳定性. 1 实验部分 1.1 仪器和仪器 CHI604D电化学工作站(上海辰华仪器公司); UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司); TECNAI F20型透射电子显微镜和XL 30场发射扫描电子显微镜(香港FEI公司); GL-3250B型恒温加热磁力搅拌器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司); LEO-50桌上型超声波清洗机(昆山力波超声波设备有限公司). 1.2 实验过程 1.2.1 壳聚糖-sisg的制备 称取0.5 g壳聚糖溶于100 mL 0.05 mol/L乙酸中, 超声振荡1 h, 得5 g/L的透明壳聚糖溶胶. 取15 μL TEOS, 60 μL乙醇和600 μL壳聚糖溶胶混合超声振荡30 min, 得壳聚糖-SiO2复合Sol-gel(SiSG), 静置2 h, 使用前加入14 μL 1.0 mol/L NaOH溶液, 调节pH值在6.0～7.0之间. 1.2.2 ache-aunps-sisg/gce传感器的制备 将玻碳电极(GCE)依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3抛光至镜面, 依次用乙醇和超纯水超声清洗, 然后将电极置于K3Fe(CN)6-KNO3溶液中, 于-0.2～0.7 V之间扫描循环伏安图, 直到电位差接近59 mV. 用微量进样器分别移取5 μL AChE(100 U/mL), 5 μL SiSG和5 μL AuNPs混合均匀, 移取5 μL混合液涂覆于处理好的玻碳电极表面, 室温下放置过夜, 制得AChE-AuNPs-SiSG/GCE传感器, 置于4 ℃冰箱中保存. 1.2.3 电化学行为的测定 检测有机磷农药时, 将AChE-AuNPs-SiSG/GCE电极浸入含有不同浓度农药的磷酸盐缓冲液(PBS, pH=7.0)中保持一定时间, 然后将电极放入底物ATCl的PBS溶液(pH=7.0)中, 用循环伏安法考察其电化学行为. 农药的抑制率通过下式计算: Inhibition(%)=[(I1?I2)/I1]×100%Ιnhibition(%)=[(Ι1-Ι2)/Ι1]×100% 式中,I1为ATCl在电极上的峰值电流;I2为加入农药抑制后ATCl在电极上的峰值电流. 2 结果与讨论 2.1 aunps粒径 AuNPs的紫外-可见吸收光谱如图2(A)所示, 其吸收峰在520 nm处, 与文献报道一致, 特征吸收峰较尖锐, 表明粒径分布较均匀. 将Au