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内生解淀粉芽孢杆菌cc09在小麦上的定殖能力 芽杆菌是目前最重要的抗生菌菌之一。苏云金芽菌制剂占世界生物源剂的90%以上。然而，用于控制植物疾病的主要是枯草芽菌制剂，它用于控制三七根腐病、水稻阴道腐败、黑草等根本病害，以及蔬菜、葡萄、芦笋等蔬菜、葡萄、芦笋等疾病的抗病性。 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的芽孢杆菌, 具有枯草芽孢杆菌的一些基本生物学和代谢特征以及促进植物生长的作用, 生防潜力巨大。目前美国已有该菌商用产品, 我国农业部也于2013年为该菌商用颁发了生产许可证, 表明解淀粉芽孢杆菌将成为新一代生防菌剂。 该文报道1株从健康樟树叶片中分离获得的内生解淀粉芽孢杆菌CC09, 该菌株能够合成广谱抗真菌活性物质Iturin A, 摇床发酵产量高达300μg/m L。鉴于内生细菌能在植物体内定殖的特点以及该菌的广谱抗真菌活性, 该文研究了菌株CC09在小麦叶际、叶内的定殖能力及其防治小麦白粉病的效果, 为该生防菌株的开发及应用提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 菌株的筛选和活性测定 供试菌株为内生解淀粉芽孢杆菌CC09 (CGMCC No.4669) ;供试白地霉Geotrichum candidum, 由南京大学生命科学学院分子与应用微生物实验室保藏;供试小麦品种为“豫麦49号”, 购于江苏省农业科学院;供试小麦白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici采自江苏省农业科学院小麦田, 于麦苗上扩繁、保存。 将菌株CC09接入含利福平0.5μg/m L的LB培养基中, 摇床培养12 h, 涂布于含相同浓度利福平的LB固体培养基上, 培养24 h, 转入含利福平浓度更高的培养基中, 直至筛选出能在含300μg/m L利福平的LB培养基上稳定生长且生理特性与原始菌株一致的突变菌株CC09rif。并采用菌饼法测定标记菌株与原始菌株发酵液上清对白地霉的皿内抑制活性, 方法如下:将培养至2×108cfu/m L的菌株发酵液经12000 r/min离心收集上清液, 取1 m L上清液与9 m L LB培养基混匀并倒平板。然后用1 m L的灭菌移液枪头在白地霉培养平板上打菌饼并使菌面朝下倒扣于上述含发酵液上清的平板上, 于27℃培养箱中倒置培养48 h, 测定其抑菌活性。 1.3 小麦叶的消毒处理 菌株CC09及其抗性标记菌株 (CC09rif) 于37℃、120 r/min过夜培养活化得种子液, 按3%接种量转接到含250 m L培养基的1 L三角瓶中, 同样条件培养60 h, 所得菌株发酵液稀释到2×108cfu/m L备用。 选取饱满一致的小麦种子, 经自来水浸泡6 h后置于25℃恒温培养箱中催芽, 待其露白后播种在直径14 cm的盛有自然土的花盆中, 培养至二叶期备用。 采用喷雾方法 (菌液浓度2×108cfu/m L) 处理二叶期小麦苗, 喷施菌液至均匀沾满叶片但不滴落, 设无菌水对照, 每处理3盆, 于25℃恒温光照培养箱中培养 (湿度65%左右) , 分别在处理后1、3、7、10、15 d取样调查小麦叶际和叶内的细菌数量。 叶际:随机采取4片小麦叶, 称重后放入装有20 m L无菌水的三角瓶中, 置于摇床上200 r/min振荡30 min, 超声波 (40 Hz) 处理4 min后, 将洗脱液转移至50 m L无菌离心管中, 12000 r/min离心10 min, 留取沉淀2 m L, 梯度稀释后取100μL均匀涂于含利福平300μg/m L培养基平板上, 37℃培养过夜后计数。根据每皿中的菌落数量, 计算每克鲜叶片中所含的菌量。 叶内:参照文献的方法并加以改进。在超净台内对小麦叶片进行表面消毒处理, 依次用75%酒精漂洗1 min和1%次氯酸钠浸泡2 min, 再用无菌水清洗4次, 取最后一次无菌水冲洗液100μL涂布于抗性平板, 37℃培养24 h, 检验消毒效果。然后吸干表面水后用2 m L无菌水研磨至浆糊状, 静置15 min使组织内细菌充分释放出来, 取100μL组织悬浮液梯度稀释后涂布于含利福平的LB平板上, 检测细菌数量。 1.5.1 cc29rif菌回复突变试验 代谢产物对定殖的影响:菌株CC09rif发酵液经12000 r/min离心10 min, 弃上清, 菌体用LB培养基重悬。根据浸膏得率换算, 在CC09rif菌体重悬液中分别添加相当于原发酵液中0倍、1倍和4倍代谢产物含量的浸膏。按照1.4方法喷施和取样处理调查代谢产物对菌株在小麦叶际与叶内定殖的影响。 发酵液的喷施处理方式及取样处理参见1.4, 喷施菌液浓度分别为2×109、2×108和2×106cfu/m L。 发酵液的喷施处理方式及取样处理参见1