植物环蛋白显色方法的研究.docxVIP

植物环蛋白显色方法的研究 植物环苷一般是指植物环苷最重要的结构单元。目前发现的植物环苷主要由2-37个l-结构的编码氨基酸组成。他们的研究历史可以追溯到20世纪80年代。自1959年首次植物环苷结构确定以来，在1968年提出了细菌酶的概念，并于2006年定义了植物环苷。从大约25个科65类120种高等植物中发现了450多种植物环苷，分为以下8种：环磷酶（i）、环磷酶（ii）、茄子环己（iii）、箭头环己（iv）、科维科环烯（h）、石竹环素（h）、箭草环素（h）和环蛋白质（h）。 植物环蛋白(cyclotides)也称堇菜科类型环肽(violaceae-type cyclopeptides),是植物体内一类富含二硫键,由28至37个氨基酸残基通过肽键首尾连接的大环肽.其分子中除了含有首尾相连的环状骨架外,还存在6个非常保守的半胱氨酸残基,它们两两之间形成三对二硫键,其中的两对二硫键和环状骨架形成一内环,而第三对二硫键则穿过这一内环形成一独特的环状胱氨酸结(cyclic cystine knot,CCK).植物环蛋白的CCK结构特征使其特别稳定,能耐常规的酶解和酸解.最早的植物环蛋白报道为20世纪70年代早期关于非洲热带茜草科植物Oldenlandia affinis的报道,挪威医生Lorents Gran发现非洲扎伊尔等地妇女临产前常饮用该植物煎制的茶来催产,后经其研究从该植物的沸水提取物中发现了一种具有子宫收缩作用的多肽(即kalata B1).当时通过氨基酸分析只确定了其大多数氨基酸残基和环状特性,直到1995年才由Craik等通过二维核磁共振谱和距离限制模拟退火计算分析(distance-restrained simulated annealing)解析出其氨基酸序列、环状骨架和三维结构.至今人们已从堇菜科、茜草科和葫芦科十多种植物中发现了近百个环蛋白分子.植物环蛋白具有广泛而多样的生物活性,如子宫收缩、抗HIV、神经紧张素抑制剂、抗微生物活性、胰蛋白酶抑制剂、细胞毒活性和杀虫活性等.基于环蛋白在堇菜科堇菜属植物中具有组织特异性表达的特点,Craik等认为环蛋白在植物体内可作为防御性多肽而起杀虫和抗菌的作用,提出环蛋白可能是一类新的植物防御多肽家族.环蛋白一方面由于其内在的活性可能被直接用作药物或作为新药研究的先导结构;另一方面由于其精确的三维结构、高稳定性和其中一些环(loop)中氨基酸残基的可变性,可连接其他活性新颖的物质而可能成为在多肽药物设计上非常有用的骨架结构. 2000年我们报道了一种检测植物环肽的薄层层析新方法,其原理是植物环肽类化合物在薄层板上实行原位酸水解、游离出N端后再用茚三酮试剂显色.应用该法我们已分离发现了一百多个石竹科类型环肽,该法重复性好,灵敏度高,曾很好地指导了我们在环肽的分离纯化工作,极大地提高了环肽的分离效率.2005年我们在植物小环肽研究基础上,展开了植物环蛋白的研究工作,其间发现原有环肽检测方法在环蛋白的识别中存在不足.本文用碘、碘化铋钾、茚三酮和考马斯亮蓝G-250四种显色剂对包括植物环蛋白在内的3种寡肽以及氨基酸和蛋白质在薄层层析板上进行了5组显色反应研究,建立了环蛋白的新的薄层层析显色反应.应用该显色方法开展了三色堇、紫花地丁、如意草、木鳖子和苦瓜等5种植物的环蛋白的检测和纯化工作,均检测出环蛋白,分离获得十多个环蛋白,鉴定了其中的3个为已知环蛋白cycloviolacin O2,kalata B1和vary pep-tide A. 1 氨基酸的纯化 (ⅰ)试剂与材料.常用的氨基酸显色剂有茚三酮等,蛋白质显色剂有茚三酮、考马斯亮蓝、双缩脲试剂、Folin酚试剂等.考虑到显色方法的简便性和显色对象的广泛性,选择了茚三酮和考马斯亮蓝作为显色剂,我们还选取了通常作为生物碱显色剂的碘和碘化铋钾作为参考.为了使考马斯亮蓝G-250能适用于薄层层析而且对分子量相对较小的环蛋白更为敏感,我们还改进了其配方,配法如下:用20 m L乙醇溶解100 mg考马斯亮蓝G-250,然后加入20 m L磷酸,以50%乙醇定容至200 m L.茚三酮显色剂为0.2%的茚三酮乙醇溶液.碘为固体碘.碘化铋钾试剂即改良的Dragendorff试剂,配法如下:0.85 g次硝酸铋溶于10 m L冰醋酸,加水40 m L为甲液;8 g碘化钾溶于20 m L水中为乙液;1 m L甲乙液等体积混合液,加2 m L醋酸和10 m L水混合即得. 我们选取了脯氨酸(P,亚氨基酸)、赖氨酸(K,碱性氨基酸)、谷氨酸(E,酸性氨基酸)、甲硫氨酸(M,非极性氨基酸)和色氨酸(W,极性氨基酸)作为各类型氨基酸代表,为上海康达氨基酸厂生产的生化试剂.太子参环肽B[HB,cyclo-(PPPIFGGL)]和cycloviolacin