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西藏灵菇发酵奶抗衰老作用的初步研究 0 解决肉毒以及抗衰老机理的研究 西藏天竺葵是一种天然野生动物的少菌之一。它由多种菌组成，包括60%70%的细菌、双螺菌、酵母菌和芽杆菌。西藏灵菇发酵奶与普通酸奶相比有很多优点,其乳酸营养、维生素种类及含量更为丰富,残存的葡萄糖和半乳糖的含量极低,非常适合乳糖不耐症患者饮用。长期饮用由西藏灵菇发酵的酸奶能治痤疮、肿瘤等多种疾病,调节肠道菌群、提高免疫功能,降低血液中的胆固醇,并有可抗衰老的传说。但一直没有正式的科学依据证明其抗衰老机理。 在此研究中设立了过氧化氢酶(catalase,CAT)、单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)、总抗氧化能力(total antioxidant capability,T-AOC)、羟自由基(hydroxyl free radical)的含量检测,同时,也设立了野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster,fruit fly)平均寿命(average life)、半数存活时间(half survival time,ST50)和最长平均存活时间(averaged maximum survivable time)等指标,通过验证西藏灵菇发酵奶(Tibetan kefir fermentation milk)是否具有抗氧化作用和延长寿命的作用,从而确定其是否具有抗衰老功能。 1 实验 1.1 生物工程试剂 LX3-64-01型高速离心机,LRH-250A生化培养箱,ELX800型酶标仪。 过氧化氢酶(CAT)测试盒、单胺氧化酶(MAO)测试盒、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒、羟自由基测试盒均购于南京建成生物工程研究所。 西藏灵菇菌粒,光明纯鲜牛奶,光明原味酸牛奶;果蝇玉米基础培养基。 雄性ICR小鼠,体重为20 g±1 g,购自北京大学医学部第三附属医院(饲养批准号:SYXK(京)2006-0025);野生型黑腹果蝇。 1.2 实验方法 1.2.1 西藏灵蘑菇发酵奶的制备 将西藏灵菇菌粒加入光明纯鲜牛奶中,接种量为5%,27℃发酵24 h,pH值为3.7~3.8时结束发酵,冷藏保存,3 d内使用。 1.2.2 分组及给药剂量单次采血法检测b 将60只小鼠随机分为6组,每组10只。每天8:00和16:00分别灌胃一次,共给药28 d,分组及给药剂量如表1所示。 于给药前和给药的第7、14、21、28 d上午9:00点通过眼眶采血法采样,每次取血约为100 μL,4 000 rpm离心5 min,取血清备用。于第0、5、10、15、20、25 d,8:00对小鼠进行体重检测,计算平均值及标准偏差。 1.2.3 酶标仪测定酶吸光度 按试剂盒要求对血清进行检测,96孔酶标板每孔加样0.23 mL,酶标仪于405 nm处测定吸光度。按下式进行计算: CAT(U/mL)=(对照OD值-测定OD值)×271×[1/(60×取样量)]×样品稀释倍数,并对d 28数据与d 0的差异进行显著性检验。 1.2.4 酶活性测定ml 按试剂盒要求对血清进行检测,96孔酶标板每孔加样0.68 mL,用酶标仪于242 nm处测吸光度。按下式进行计算: MAO(U/ mL)=测定OD值/0.01÷3 h÷取样量(mL),并对d 28数据与d 0数据的差异进行显著性检验。 1.2.5 含量测定 按试剂盒要求对血清进行检测,96孔酶标板每孔加样0.37 mL,用酶标仪于550 nm处进行测定。按下式进行计算: 总抗氧能力(U/mL)=(测定OD值-对照OD值)/0.01÷30×(反应液总体积(mL)/取样量(mL))×样品稀释倍数,并对d 28数据与d 0数据的差异进行显著性检验。 1.2.6 nm处的测定 按试剂盒要求对血清进行检测,96孔酶标板每孔加样0.28 mL,用酶标仪于550 nm处进行测定。按下公式进行计算: 羟自由基(U/mL)=(对照OD值-测定OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准管浓度(8.824 mmol/L × 1 mL /取样量)×样本稀释倍数,并对d 28数据与d 0数据的差异进行显著性检验。 1.2.7 高剂量材料人工诱导法含药量组 取8 h内新羽化的野生型黑腹果蝇成虫40只,分空白对照组、低剂量组(含药量5%)、中剂量组(含药量10%)和高剂量组(含药量15%),每组10只,雌雄各半,于内有2 cm厚玉米培养基的3.0 cm×10 cm的指形管中,于25±1℃,相对湿度50±5%的条件进行培养,每4 d更换一次新配培养基,记录生存数和死亡数,直到全部果蝇死亡,重复10次。计算半数死亡时间、平均寿命和平均最长寿命。 2 动物机体防护体系 目前衰老机理中的自由基衰老理论认为:当人体细胞受到氧自由基的破坏性冲击使衰老发生,维持体