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拟穴青蟹家系选育技术 属于甲壳类、甲壳类、短尾亚类和梭子类。广泛分布于印度-西太平洋沿岸水域，主要分布于中国东南沿海水域。青蟹属包括4个种,在我国最常见的为拟穴青蟹(Scylla paramamosain),是我国重要的经济养殖蟹类之一。随着拟穴青蟹养殖规模的不断扩大,对拟穴青蟹苗种的需求量也越来越大,优良品种的选育就显得尤为重要。目前,对于拟穴青蟹苗种生产的研究成果主要集中在通过改善培育环境以提高不同生长阶段苗种的成活率,但这尚不能完全满足市场需求。因此,培育生长性能好、耐受力强的优质品种,将大大促进拟穴青蟹养殖产业的发展。 家系选育是选择育种中的一种重要方式,即从群体中选出优良的个体,然后按照个体建立家系,再选择优良的家系作为繁殖后代的亲本,淘汰不良家系,由此逐代提高品种的遗传纯合性,选出具有稳定优良性状的新品种。迄今为止,家系选择已经在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、鲤(Cyprinus carpio)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)及中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)等多种水产动物的育种工作中取得一定成果。然而,家系选育中也存在一些问题,如近交衰退、有效群体减少等,为了避免这些现象的产生,研究不同家系的遗传信息非常重要,不但可以了解种质资源情况,还可以为家系育种提供重要的理论数据。 微卫星(Microsattelite)又称简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSR),是广泛分布于基因组中的重复序列,由2～6个核苷酸的串联重复片段构成。微卫星标记具有等位基因数目多、多态性高、共显性和符合孟德尔遗传等特点,因而广泛应用于遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建以及亲子鉴定等研究中。迄今,日本和我国学者已相继开发了拟穴青蟹的微卫星标记,并分别运用开发的微卫星标记对拟穴青蟹野生群体的遗传变异进行了研究。截至目前,尚没有关于拟穴青蟹不同家系遗传多样性的报道。本研究利用8个多态微卫星标记对6个拟穴青蟹家系的遗传多样性进行了比较分析,揭示其遗传变异情况,以期为开展拟穴青蟹家系选育工作提供基本资料,并促进拟穴青蟹优质新品种的选育。 1 材料和方法 1.1 亲蟹的选择与培养 拟穴青蟹家系构建于东海水产研究所海南琼海研究中心。亲蟹在自然环境中生长和交尾。挑选体格健壮、肢体齐全且体表无创伤的雌性亲蟹进行暂养并繁育后代。待子一代幼蟹生长至仔蟹二期时,分别采集6个家系48、44、48、39、48、48 ind,并命名为1、2、3、4、5和6号家系。样本采集后保存在95%的乙醇中备用。 1.2 学习方法 1.2.1 sds-苯酚氯的提取 采用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,每尾拟穴青蟹幼体置于2 mL离心管中,加入600 μL抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl,100 mmol/L EDTA,pH 8.0)、终浓度为1%的SDS以及100 μg/mL蛋白酶K,55 ℃消化2～3 h,然后依次加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)进行抽提,最后经2倍体积无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,双蒸水溶解。DNA经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测质量,紫外分光光度计(BECKMAN DU800)测定浓度并稀释至约100 μg/mL,保存于-20 ℃备用。 1.2.2 pcr反应条件 多态性微卫星标记来自本实验室前期利用RAPD随机扩增微卫星分离法(PIMA)和5′-锚定PCR法开发的引物(表1),由上海生工合成。反应体系为12.5 μL,包括1×PCR缓冲液,1.5 mM MgCl2,0.25 mM dNTP,上下游引物各0.5 μM,0.5 UTaqDNA 聚合酶(TaKaRa),模板DNA约100 ng,去离子水补足。反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,退火50 s(退火温度见表1),72 ℃延伸50 s,共35个循环;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染显色,并拍照保存。 1.2.3 各态性指标的计算 根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型,利用Popgen 3.1软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、遗传距离(Da)及哈迪-温伯格平衡显著性检测P值,用PIC_Cal6软件计算多态信息含量(PIC)。在MEGA 4.1软件中基于遗传距离构建UPGMA树。利用Arlequin 3.1软件中AMOVA方法分析6个家系的遗传变异,计算遗传分化系数FST。 2 结果与分析 2.1 个位点的遗传多样性 6个家系在8个微卫星位点中,分别有3个家系各自在1个位点表现出单态(3号家系在位点