重庆地区桔小实蝇遗传分化研究.docxVIP

重庆地区桔小实蝇遗传分化研究

0重庆地区设计0.2年生时期生物多样性研究

根据研究，这种类型的蝗虫是一种广泛而严重的国际检疫害虫。该虫原产于亚洲热带和亚热带地区,在中国、东南亚、印度次大陆、夏威夷群岛均有分布。桔小实蝇自1911年于中国台湾发现以来,目前已扩散至广东、广西、湖南、云南、海南、四川、贵州、福建,在华中和华南地区已造成了严重危害。随着全球气候暖化,桔小实蝇的分布范围还会逐渐扩大。据监测,桔小实蝇近年已侵入重庆地区,在多个区、县发生和危害。随着国内和国际贸易的日益频繁,桔小实蝇的入侵途径不再局限于自然状态下的扩散,还会随着果蔬调运侵入新的适生区,对重庆地区桔小实蝇种群分化的研究不仅可以明确重庆地区桔小实蝇的入侵和扩散机制,同时对今后全国范围内的桔小实蝇入侵和扩散机制研究以及制定更有针对性的检验检疫措施都具有重要意义。【前人研究进展】肌动蛋白基因、微卫星分子标记、线粒体基因及RFLP均可用于桔小实蝇遗传结构的分析。在国外,1997年He等最早利用肌动蛋白基因研究了2个室内种群和3个野外种群桔小实蝇的遗传分化情况。Dai等,Aketarawong等,Muraji等,Nakahara等分别以微卫星分子标记方法,对不同地理种群桔小实蝇的遗传变异进行了研究。在国内,施伟等通过测定mtDNACOⅠ基因部分序列对云南省桔小实蝇5个常年分布区及4个季节性分布区种群的遗传分化情况进行了分析。康芬芬等,李伟丰等利用微卫星分子标记研究了国内及邻近的越南等地桔小实蝇种群遗传结构,并初步分析了其传播途径。【本研究切入点】侵入重庆地区的桔小实蝇种群是来源于一个还是多个分布区,是循着怎样的路线迁入危害的,其种群遗传分化研究将是一个突破口。【拟解决的关键问题】本文利用8对微卫星引物对重庆地区6个桔小实蝇种群的遗传分化情况进行研究,以期为揭示这6个地理种群间的内在联系及探究重庆地区桔小实蝇的遗传结构提供分子生物学证据。

1材料和方法

1.1来自本地格式的资源

本试验供试标本均为重庆市植保植检站监测诱集标本。所有供试标本均浸泡于95%乙醇中4℃保存,标本详细信息见表1。

1.2pcr检测微卫星dna多态性

本文所选用的8对微卫星引物均来自文献[4,12-15](表2)。试验表明,各对引物均具有一定多态性,扩增条带稳定出现且清晰,适于用作微卫星DNA多态性分析。引物由上海英骏生物有限公司合成。

1.3动物组织和血液dna提取

桔小实蝇供试标本去腹,以去离子水冲洗两遍后稍晾干备用。DNA提取按照德国QIAGENE公司的DNeasyBloodTissueKit动物组织和血液DNA提取试剂盒的说明书进行。以核酸浓度测定仪检测DNA浓度,以1%琼脂糖电泳检查基因组DNA的完整性。

1.4pcr扩增及产物的表达

PCR扩增反应总体积为25μL,其中10×buffer2.5μL,Mg2+(25mmol·L-1)1.5μL,dNTPs(10mmol·L-1)2.0μL,上下游引物(10mmol·L-1)各1.25μL,TaqDNA(5U·μL-1)聚合酶0.2μL,模板DNA约20ng,不足25μL的部分以灭菌去离子水补齐。扩增反应在WhatmanBiometraPCR仪上进行,反应程序为:95℃预变性5min,94℃变性1min,退火45s,72℃延伸1.5min,共进行35个循环;最后72℃终止反应7min。

PCR产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,电泳缓冲液为1×TBE,电泳结束后常规银染法染色。以BIO-RAD凝胶成像仪扫描图像,软件Quantityone计算条带大小。

1.5einger平衡检测表观杂质

根据分子量大小对扩增结果读带,以二倍体形式记录,从大到小依次记为A,B,C……。以POPGENE1.32对各种群在多基因座位上的Hardy-Weinberg平衡进行检测,计算观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态位点百分率(P)、基因多样性指数(Nei’s)、Shannon信息指数(I)、表观杂合度(Ho)和预期杂合度(He)、基因流(Nem)种群内近交系数Fis、总近交系数Fit、种群间分化系数Fst、Nei’s标准遗传距离(D)和遗传相似度(I)。根据Nei’s标准遗传距离,利用MEGA4.0中的非加权平均算术法(UPGMA)对各种群进行聚类分析。

2结果

2.1pcr扩增结果

8个微卫星分子标记在6个桔小实蝇种群中扩增片段的片段长度为95—211bp,部分扩增结果见图1。

2.2南、北料和麻黄种群的位点分布

采用卡方检验对各种群的多基因座位进行检测发现,6个桔小实蝇种群中除北碚种群、秀山种群、武隆种群及永川种群在位点4.3A,江津种群在位点5.8A上符合Hardy-Weinb