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基于mrna技术的草鱼低温诱导dna片段的筛选
1992年，liang和pardeg根据高等生物成熟的mrna具有形态特征，在pcr扩增的情况下，建立了不同的mrna显示技术（mrnadipplynt然遗传模型mrnadpcr）（liang，1992）。现在，该技术发现了300多个新基因，表明它们的完整性和良好的发展前景（叶显志1999）。
Liang等所建立的DD-PCR技术用6%的测序聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增时要加入同位素还要放射自显影因此实验周期长成本高易造成环境污染实验的限制因素较多本文通过对PCR引物的改良用琼脂糖凝胶电泳EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影使得工作大大简化应用这一技术分离得到70个草菇低温诱导DNA片段
1材料和方法
1.1vaceav3菌株的分离和鉴定
草菇(Volvariellavolvacea)V23采自上海草菇产地南汇县草菇菌株V23由供试的南汇草菇中经组织分离获得并由本所菌种保藏中心保藏
1.2不同低温处理对草菇的培养
草菇菌株接入PDY液体培养基(马铃薯20%,葡萄糖2%,酵母提取物0.1%),32恒温静止培养5d后,一部分草菇菌丝在4低温分别处理1234h用400目的滤网过滤收集草菇正常菌丝和低温处理菌丝菌丝用无菌蒸馏水冲洗数次用滤纸吸干水分,于-70冷冻2h后在T-55P310-2mba的条件下于冷冻干燥机EDWARDS英国中冷冻干燥24h得到草菇样品的干燥菌丝于-70保存
1.3rna的纯化
采用TRIzol试剂上海华舜生物工程有限公司对草菇样品进行RNA制备提纯的RNA利用RQ1RNase-FreeDNase(Promega)去除DNA得到纯化的RNA
1.4mrna差异筛选法
1.4.1rnacdt反转录酶检测
cDNA合成反应总体积为20ìl其中含有50mmol/LTris-HClpH8.375mmol/LKCl3mmol/LMgCl210mmol/LDTT0.2mmol/LdNTP25UnitRNA酶抑制剂(Promega)1ìl50mmol/L反转录锚定引物(生工)20UnitM-MuLV反转录酶(Promega)200ng的经变性的样品RNAcDNA合成反应在PTC-100PCR扩增仪M.J.ResearchInc.中进行程序为28°C10min37°C90min95°C5min灭活反转录酶(陈明杰等,1998)
1.4.2pcr扩增及测序
在20ìl的反应体系中含有1×PCR缓冲液(Promega)1ìl逆转录的cDNA模,1.5mmol/LMgCl2250μmol/LdNTP(Promega)1.25μmol/L随机引物1.5μmol/L反转录锚定引物和2.5UDNA聚合酶(Promega)在PTC200PCR扩增仪M.J.ResearchInc.中以94°C5min40°C1min72°C1.5min以及94°C1min40°C1min72°C1.5min35个循环最终72°C10min的程序进行PCR反应
随机引物及锚定引物均购置于上海生工生物工程技术服务有限公司
反转录锚定引物Oligo-p(dT)13AOligo-p(dT)13COligo-p(dT)13GOligo-p(dT)14随机引物见下表
1.4.3dna分子量的检测
在含0.5TBE缓冲液的2%SeakemLE琼脂糖(FMC)中以DNA100bpladder(Promega)以及1kbDNALadder(Promega)为DNA标准分子量5v/cm电泳1.5h电泳结束后凝胶在0.5ug/ml的EB中染色20min置PharmaciaBiotech公司的ImageMasterVDS仪器上拍照纪录并采用该计算机软件计算出DNA样品的分子量
1.5dna回收纯化
扩增特异的DNA谱带用割胶铲上海华舜生物工程有限公司从琼脂糖凝胶中割下采用上海华舜生物工程有限公司的柱离心式小量胶回收试剂盒进行DNA回收纯化
1.6pcr纯化方法
取0.01ìg回收纯化DNA采用相应的引物按陈明杰等陈明杰等1996b所描述的方法进行专一PCR扩增扩增产物在含0.5TBE缓冲液的3NuSeive琼脂糖(FMC)检测为一条带后采用上海华舜生物工程有限公司的柱离心式小量PCR纯化试剂盒进行PCR产物的纯化
1.7pcr扩增回复突变dttp和其他扩增产物
取0.01ìg回收纯化低温特异DNA采用相应的引物在50μlPCR反应液中以133μmol/LdTTP(Promega)和67μmol/Ldig-dUTP(BoehringerMannheim)替代200μmol/L的dTT
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