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1.3.4 产酸曲线的绘制 酶液在40℃每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸的酶量为
将菌株接种于斜面上培养 24～48h 取出,挑取部分 一个蛋白酶活力单位（u ），最终确定所要筛选的菌株。
菌落到种子培养基中活化。活化培养24h 后，取 10mL 1.4.3 菌株的鉴定
菌液接种于90mL 发酵培养基中，继续培养。24h 后， 对筛选的菌株进行形态学和分子生物学鉴定[8,9] 。
取10mL 菌液接种于MRS 培养基中培养，每隔2h 取样， 菌株的 ITS 序列鉴定：通用引物 ITS1:
测定乳酸含量。以培养时间为横坐标，乳酸含量为纵坐 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’ 、 ITS4: 5’-
标，绘制菌体的产酸曲线。 TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 反应条件：95℃
1.3.5 浸泡效果评价 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环；72℃
在玉米浸泡阶段设0.2 %亚硫酸、10 %嗜热菌、0.2 % 10 min，4℃保存。PCR 产物经回收纯化后送至上海美
亚硫酸+10%嗜热菌3 个处理，观察籽粒达到饱和时各处 吉生物进行测序，使用比对软件 Clustal 对 rDNA-ITS
理所需时间。 序列进行同源性比对和进化树分析。
1.４ 产酸性蛋白酶菌株的筛选 1.5 发酵液在玉米淀粉生产中的应用
1.4.1 菌株的筛选 采用正交试验设计。称取15.00g 玉米，按照料液比
-3 -4 -5
取田园土壤，稀释成不同梯度（10 、10 、10 、 1: 3 的比例进行浸泡，初始pH 值3.5，浸泡温度50℃，
-6 -7
10 、10 ），然后取1mL 涂布在pH 值为3.5、4、4.5、5 添加不同浓度的嗜热乳酸菌发酵液，初次浸泡一定时间
的PDA 培养基上，在50℃培养培养4 天，挑取单个菌 后，粗破碎，去胚芽和种皮，添加不同浓度的烟曲霉发
落进行反复划线分离培养，菌株再经牛奶和淀粉平板鉴 4
酵液，再次浸泡一定时间，测定淀粉得率。采用L16(4 )
定，挑选出产蛋白酶活力强而产淀粉酶活力弱的菌株。 正交表进行正交试验，正交试验因素水平如表1 所示。
1.4.2 酶活力的测定
取发酵培养5 天的菌液，3000r/min 离心10 分钟，
取上清液，利用福林酚法测定蛋白酶的活力。1ml 蛋白
表1 正交实验表
Table 1 Orthogonal table
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