护骨素对人骨巨细胞瘤体外单核基质细胞培养影响研究.docxVIP

山州医科＾学『晚Ｉ学付．仑史前言骨巨细胞瘤（ＧｃＴ）是一种常见的具有潜在恶性的骨肿瘤，约占骨肿瘤发病的１４－１６％，２０～５０岁多见，多发生于干骺端，约６５％发生在膝关节附近，具有局部侵袭性破坏骨质Ⅲ、复发和转移的潜在恶性特征．局部主要表现为溶骨性的病变。。。目｜ｊｉ『，多数ＧＣＴ的治疗是病灶刮除加植骨，但其复发率很高”１，长骨的局部复发率约４０％～６０％，复发与不复发的ＧＣＴ在细胞的多倍性（ｐｌｏｉｄｉｔｙ）方面有明显区别“３，因此，探讨更加安全有效的辅助治疗手段对防治ＧＣＴ的复发、转移、恶变具有重要意义。自１９９７年发现护骨素（ＯＰＧ）以来，人们越来越多的关注其对单核基质细胞抑制分化、成熟和促进凋亡的作用。最新研究表明：ＯＰＧ主要通过与肿瘤组织中与ＲＡＮＫＬ竞争结合ＲＡＮＫ婶１，抑制基质细胞分裂繁殖或分化成熟，ＯＰＧ还可以预防肿瘤细胞引起的骨转移，并能抑制已有的骨转移病灶的发展“１。本实验原代分离培养ＧＣＴ单核基质细胞，观察了ＯＰＧ对人Ｓｔｃ增殖和凋亡的影响，为ＯＰＧ应用于临床治疗ＧＣＴ提供初步的实验和理论依据。８１１Ｉ屿医辩人卞碗Ｉ学付沦Ｚ材料和方法１材料标本来源‘８例长骨骨巨细胞瘤手术标本由山西医科大学附属二院骨病科提供。所有标本均经病理切片诊断核实。主要试剂ＤＭＥＭ高糖培养基（Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）：胶原酶刀（Ｓｉｇｍａ公）；０．５％胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ公）：抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色试剂盒（中国医学科学院血液研究所）；逆转录试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｔａｑ酶（上海生工生物工程有限公司）；引物合成于上海博亚生物工程有限公司；ＯＰＧ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ公司）；ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ公司）；碘化丙啶ＰＩ（Ｓｉｇｍａ公司）。２方法２．１狗股骨磨片的制备’’将新鲜的狗股骨纵切１００ｕｍ厚，用金刚砂石磨制成１０ｐｍ骨薄片，无菌ＰＢＳ沈涤３次．每次１０分钟。然后浸泡于含青霉素（１９／１）和链霉素（１９／１）的无菌ＰＢＳ液３次，每次２０分钟，再次用无菌ＰＢＳ沈涤３次，每次１０分钟，最后置于ＤＭＥＭ培养液中，高压蒸气灭菌３０分钟，备用．２．２骨巨细胞瘤单核基质细胞的分离培养及纯化在无菌条件下取骨巨细胞瘤质脆软的部分（０．５Ｘ０．５Ｘ０．５ｃ岔），用含青霉素（１９／１）和链霉素（１９／１）的无菌ＰＢＳ液中浸泡３遍（每次１０分钟），至颜色淡白，在含１５１ｊ６（体积分数）胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中用眼科小剪刀轻轻剪碎，加入现配好的腔原酶口（１０ｍｇ／ｍ１）ｌｍｌ，吹吸数十次后，放入３７℃水浴箱中，孵育５０分钟（不断摇摆并注意无菌操作），然后使用２００目滤网过滤，ＮＡ，６—８ｍｌ含１５％胎牛血清ＤＭＥＭ，４＂Ｃ１０００ｒ／ｍｉｎ离，ＬＭ０ｍｉｎ。弃去上清液，加入３—４ｍｌ含１５％胎牛血清的ＤＭＥＭ，吹打均匀，将细胞接种到培养瓶中。将培养瓶放）、｜３７＂Ｃ５％Ｃ０。细胞培养箱中８ｄ，时。弃去未贴壁细胞悬液，无菌ＰＢＳ清洗２次，胰酶消化１－２分钟，加入含１５％胎牛血清的ＤＭＥＭ，欧打均匀后放入孵箱，重复２－３次可以达到纯化。２．３骨巨细胞瘤中单核基质细胞性质的探讨２．３．１倒置显微镜观察：培养过程中，定期用倒胃显微镜观察细胞的形态和生长状况：分离培养的瘤细胞，在纯化以前可见大量未贴壁的血细胞，私少部分贴壁的多核巨细胞，胰酶消化２—３次后，多核巨细胞变少甚至消失。纯化的单核基质细胞呈上皮形，梭形或多角形（图１），排列成束状或漩涡状，４—５天长满传代，２－３天换液。其中２例作长期培养，可以传２５—３０代，为期１００天。２．３．２ＴＲＡＰ染色：９ｄ』ｌＩＩｉ医科人々碗Ｉ于忙论上纯化后的细胞爬片，ＰＢＳ沈３次后染色（按试剂盒所示进行）．２．３．３体外骨吸收试验；实验组加入经胰酶消化的第４代瘤细胞悬液以及处理过的薄骨片，对照组为１ｊ％胎牛血清的ＤＭＥＭ加薄骨片，放入３７＂ＣＣ０：培养箱，分别于ｌ、３、７、１４天用倒置显微镜观察骨片变化，观察后取出并将骨片用ＰＢＳ洗３次，再用胰酶浸泡１０ｚ（３－４分钟），ＰＢＳ再沈２次，紫外灯下自然干燥后剪成５×５ｍｍ２大小，备用，四个时『白Ｊ点骨片收集齐全后扫描电镜观察。２．３．４检测特征性基因表达：加入Ｔｒｉｚｏｌ并吹打裂解细胞，抽提总ＲＮＡ，取２ｕｇ总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，取１ｕ１ｃＤＮＡ进行ＲＴ．ＰＣＲ扩增降钙素受体和细胞核因子ＫＢ受体活化因子（ＲＡＮＫ）的表达，反应总体积２０ｐ１，引物序列及反应条件（见表１）“１。扩增产物在１．５％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色显影并照相。２．４ＯＰＧ对体外ＧＣＴ单核基质细胞的影晌：２．４．１细胞毒性实验（ＭＴＴ）用０．０５％胰酶消化纯化后Ｓｔｃ（第３—５代），调整细胞数为９×１０７几，转入９６孔培养板，每孔接种２００ｐ１，用