去甲肾上腺素对外周细胞炎性因子表达影响.docx

CD137、IL-6等进行了初步研究，观察到应激浓度的去甲肾上腺素上调 THP-1细胞 CD137、IL-6基因的表达。为进一步研究去甲肾上腺素对外周细胞炎性因子表达的影响，我们采用应激浓度的去甲肾上腺素作用 THP-1细胞、THP-1巨噬细胞、内皮细胞，观察其对 CD137、IL-6、HMGB1基因[11]表达的影响，旨在探讨应激水平的儿茶酚胺类激素在 As发生或发展中的作用。91实验材料1.1主要试剂THP-1细胞RPMI-1640培养基胎牛血清EDTA Na2TRISAgaroseTrizol ReagentDiethyl pyrocarbonate (DEPC)Poly Atract mRNA Isolation SystemIIIReverse Transcription SystemUNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒[α-32P]dCTPBD PCR-Select? cDNA Subtraction KitpMD18-T质粒Advantage PCR cloningGeneRulerTM DNA Ladder MixPUC Mix8 Marker2×Taq MAstermix PCR反应体系羊抗人 CD137多克隆抗体HRP标记兔抗羊二抗蛋白质印迹试剂盒化学荧光发光剂丽春红染色试剂BluRanger预染蛋白分子量标准IL-6 ELISA kitNoradrenalineGAPDH、CD137、IL-6、HMGB1引物10中国科学院上海细胞库GIBCO公司杭州四季青公司Bebco公司AMRESCO公司Spanish分装Invotrogen公司Sigma公司Promega公司Promega公司上海生工北京市福瑞生物工程公司Clontech公司Clontech公司Clontech公司晶美公司晶美公司北京天为时代公司Santa Cruz Biotechnology, INC.Santa Cruz公司Amersham life science, UK.Santa Cruz公司Sigma公司Hyclone-Pierce公司TPI Inc. USASigma公司上海生工合成氯仿、异丙醇、乙酸钾、乙酸钠、甲醛、丙三醇、无水乙醇、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯试剂。1.2仪器设备-20℃冰箱-80℃超低温冰箱高压蒸汽灭菌器蛋白质/核酸分析仪高速冷冻离心机pH计微量移液器水浴箱电子天平电穿孔仪手提紫外灯2300型 CO2培养箱Olympus倒置显微镜梯度 PCR仪凝胶成像系统酶联免疫检测仪海尔HARRIS日本 TOMYBECKMAN COULTERTHERMO公司METTLER EOLEDOEppendorf公司JULABOSHIMADZU公司Bio-Rad公司Upland公司SHEL LAB公司Olympus公司Eppendorf公司Tanon公司BIOTEK公司细胞培养净化工作台、细菌培养箱、细菌摇床等为国产仪器。112实验方法2.1 受试细胞的培养2.1.1 THP-1 细胞的培养和去甲肾上腺素作用使用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基，于 37℃、5%CO2的培养箱中培养，每三天传代一次，传代时采用 0.25%的胰酶消化细胞。于传代后第一天收集细胞(此时细胞处于对数生长期)，计数后以 2×106个接种于六孔培养板，每孔含 3ml无血清培养基，第 1孔为空白对照，在第 2~5孔中加入去甲肾上腺素使其终浓度为 10 μmol/L，放回培养箱，第 2~5孔在 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下分别培养 1、6、12、24h，然后进行后续实验。2.1.2 THP-1细胞的分化和去甲肾上腺素作用人单核细胞系 THP-1细胞，使用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每三天传代一次。于传代后第一天收集细胞，以 2×106个接种于六孔培养板，每孔含 3ml培养基，再加入 3μl 100 μmol/L佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）使 PMA终浓度为 100 nmol/L，37℃、5%CO2的培养箱中培养三天，显微镜下观察显示此时细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出，证实 THP-1细胞已分化为巨噬细胞，可用于后续实验。巨噬细胞于传代后第一天收集细胞(此时细胞处于对数生长期)，计数后以 2×106个接种于六孔培养板，每孔含 3ml无血清培养基，第 1孔为空白对照，在第 2~5孔中加入去甲肾上腺素使其终浓度为 10μmol/L，放回培养箱，第 2~5孔在 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下分别培养 1、6、12、24h，然后进行后续实验。2.1.3 内皮细胞的培养和去甲肾上腺素作用人脐静脉内皮细胞 HU