16-17细胞衰老与死亡-36.pptVIP

*;*;*;*;*;*;*;*;*;一、细胞凋亡典型的特征;凋亡小体;*;*;*;*;二、细胞凋亡与坏死;*;*;*;*;四、细胞凋亡的检测 1. 形态学观察：如台盼蓝为活细胞排斥，但可使死亡细胞着色； DAPI荧光染色，磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)，荧光显微镜下观察；使用透视和扫描电镜观察等。 2. DNA电泳：可见DNA ladder，即长度为185-200bp及其整倍数的DNA片段。 3. 流式细胞仪定量分析：用流式细胞仪可检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞群体的增殖状态。;*;DAPI即 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以透过完整的细胞膜，常用于活细胞和固定细胞的染色。 ;★磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)：凋亡早期细胞，细胞膜由于磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻，可被Annexin V(一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合)-GFP(Green fluorescent protein)标记，在荧光显微镜下观察呈现绿色荧光；凋亡晚期细胞呈现红色荧光，是由于细胞膜与核膜破损，PI进入核区与DNA结合。而对照组a正常细胞不显示任何荧光。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早、晚期的细胞以及死细胞区分开来。;凋亡早期细胞，细胞膜中磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻;*;*;榄香烯50μg/ml处理K562细胞;; 五、和细胞凋亡有关的两个关键酶;*;*; 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) :雌雄同体个体最初有1090个体细胞，发育过程中131个细胞要凋亡，而且细胞凋亡的时间和位置都是固定不变的，最后成虫剩下959个体细胞。发现15个基因参与细胞凋亡调控，其中ced3、ced4基因促进细胞凋亡——死亡基因；ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡——存活基因。;;*;Caspase酶原及活化时的结构;细胞生物学教研室;*;三类具有不同BH结构域的Bcl-2成员;Bcl-2家族成员多以二聚体的方式协作调控细胞凋亡。 Bcl-2通过阻止Cyt c等从线粒体的释放抑制凋亡。而Bax、Bak、Bid等则促进线粒体上的膜通道开放，进而使Cyt c等释放，促进细胞凋亡。 ;BH123蛋白(Bax、Bak)在凋亡信号刺激下形成二聚体，从细胞质转移到线粒体外膜上，并与膜上通透性转换孔(MPTP)相互作用，使通道开放足以使线粒体内的凋亡因子如Cyt c等释放到胞质，引发细胞凋亡;Bcl-2蛋白抑制BH123蛋白二聚体的形成及活性，从而阻止Cyt c等从线粒体释放，抑制凋亡;BH3-only蛋白质(Bid、Bad)抑制Bcl-2蛋白的活性，最后促进Cyt c等凋亡因子的释放;Cyt c如何引起细胞凋亡？;（p224、图17-1）;*;*;(死亡结构域,DD);*;凋亡蛋白抑制因子(IAP)的作用;IAP的抗凋亡作用可被从线粒体中释放出来的Smac/Diablo和HtrA2/Omi解除;线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP) 是一种非特异性通道，一般认为其是由外膜的电压依赖的阴离子通道(Porin/VDAC)、内膜的腺嘌呤核苷转位蛋白(ANT)以及亲环素D等组成。VDAC是促凋亡和抗凋亡蛋白的瞄定点，是Cyt c等释放通道外膜的组成成分。在凋亡信号刺激下, MPTP 完全开放, 使很多可溶物质非选择性地自由通过, 这样就破坏了内膜的完整性, 引起两种结局: ①离子平衡紊乱, 如胞质内的质子增多, pH下降, 钙超载, 氧化磷酸化解耦 联, ATP 水平迅速下降等一系列凋亡事 件的发生。② 膜电位去极化, 基质肿胀, 使膜间蛋白如细胞色素C、凋亡诱导因子、限制性核酸内切酶等释放入胞质, 通过Caspase 依赖性或非依赖性的级联反??机制, 诱导细胞凋亡。;MPTP;一般情形下，促凋亡蛋白Bad磷酸化而成为胞质蛋白质，Bcl-2关闭门控，抑制Cyt c等释放而抑制细胞凋亡。;*;▲P53与细胞凋亡;凋亡蛋白抑制因子;生理性抑制因子 各种生长因子、细胞外基质、一些中性氨基酸、锌以及雌、雄激素。 病毒基因 腺病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒基因等。 其他 半胱氨酸蛋白酶抑制剂、促癌剂等。 ;*;;促;*;*;*;*