不同浓度丙泊酚后处理对谷氨酸致乳鼠离体脑片损伤的保护作用-麻醉学(重症医学)专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 PAGE PAGE 10 电热恒温水浴箱（600 型） 北京市永光明医疗仪器厂 台式离心机(TDL-40B) 上海安亭科学仪器厂 冰箱 电子天平 广州海尔公司 上海民桥精密科学仪器有限公司 紫外分光光度计 日本岛津公司 手术器械 贵阳医学院供应中心提供 二、方法： 1．实验试剂的制备： 1.1 磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline ，PBS）的制备： 按说明书将PBS粉剂溶于1000ml双蒸水中，使用5%的NaOH调定其pH值至7.4， 每500 ml分装，高压灭菌后封口并在4 ℃冰箱里保存备用。 1.2 琼脂的制备： 电子天平称取1.5 g琼脂粉，移入50 ml双蒸水中，搅匀，配成3%的琼脂液， 高压灭菌后冷凝，现用现制。 1.3 TTC溶液的制备： 电子天平称取TTC粉剂0.5 g，移入50 mlPBS溶液中，搅匀，配成1%的TTC染 色溶液，每5 ml避光瓶分装，常温保存。 1.4 培养基的制备： 1.4.1 不完全培养基的制备： 用针头式过滤器（孔径为0.22 μm）将DMEM/F-12培养液过滤除菌，每 42.5 ml分装，并使用5%的NaOH溶液调定pH至7.4，封口胶封口后4 ℃冰箱保存备 用。 1.4.2 完全培养基的制备： 向不完全培养基42.5 ml内加入7.5 ml胎牛血清（已灭活无菌的）, 再 加双抗溶液0.5 ml，混匀后用针头式过滤器（孔径为0.22μm）过滤除菌，再用 5%的NaOH调定pH值至7.2-7.4，用封口胶封口后4 ℃冰箱保存备用。 1.5 缺血再灌注损伤液（浓度为1mmol/L 的Glu损伤液）的制备： 将不完全培养基加入装有Glu粉剂0.147 g的容器中，滴定至50 ml，充分摇 匀，即成浓度为20 mmol/L的Glu溶液；取1 ml 20 mmol/L Glu溶液用针头式过滤 器（孔径为0.22μm）过滤至无菌烧瓶中，再加入19 ml不完全培养基，摇匀，即 成为1 mmol/L Glu溶液，每5 ml分装，4 ℃冰箱储存备用。 1.6 药物后处理培养液的制备： 1.6.1 不同浓度丙泊酚后处理培养液的制备： （1）取 2 μl 的丙泊酚中长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养基定容至 20 ml，摇匀，即配成 1 mg/L 的丙泊酚后处理液，现制现用。 （2）取 6 μl 的丙泊酚中长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养基定容至 20 ml，摇匀，即配成 3 mg/L 的丙泊酚后处理液，现制现用。 （3）取 10 μl 的丙泊酚中长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养基定容至 20 ml，摇匀，即配成 5 mg/L 的丙泊酚后处理液，现制现用。 1.6.2 不同浓度脂肪乳后处理对照培养液的制备： ①取 2 μl 的中/长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养液定容至 20 ml， 充分混匀后，即配成与 1 mg/L 的丙泊酚后处理液中脂肪乳含量相同的培养液（2 μl/20 ml），现制现用。 ②取 6 μl 的中/长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养液定容至 20 ml， 充分混匀后，即配成与 3 mg/L 的丙泊酚后处理液中脂肪乳含量相同的培养液（6 μl/20 ml），现制现用。 ③取 10 μl 的中/长链脂肪乳注射液，向内加入完全培养液定容至 20 ml， 充分混匀后，即配成与 5 mg/L 的丙泊酚后处理液中脂肪乳含量相同的培养液（10 μl/20 ml），现制现用。 1.7 10%中性福尔马林的制备： 在烧瓶中依次加入甲醛 60 ml，双蒸水 440 ml，NaH2PO4.2H2O 2.25g ，Na2HPO4 8.15g，充分摇匀，使用 5%的 NaOH 溶液将 pH 调至 7.0-7.2，装入密封瓶中避光 保存。 2.实验分组 将培养至第六天的脑片，随机分为以下8组，每组12例：正常组，Glu损伤组 （RI组），1 mg/L丙泊酚后处理组（PL1+RI组），3 mg/L丙泊酚后处理组（PL3+RI 组），5 mg/L丙泊酚后处理组(PL5+RI组)，2 μl/20 ml脂肪乳对照组（L2+RI 组），6 μl/20 ml脂肪乳对照组（L6+RI组），10 μl/20 ml脂肪乳对照组（L10+RI 组）。 3.乳鼠皮层离体脑片的制作： 具体的操作步奏参考经典脑片制作方法[5]，具体如下： 1）将实验动物（即第七天的新生SD大鼠乳鼠）使用碘酊消毒全身3 min，再用 酒精脱碘2次，每次1 min； 2）用高压灭菌后的眼科剪迅速剪短乳鼠颈椎，并快速取出大脑，将大脑立即 放入0 ℃的PBS溶液中，剪掉并丢弃脑干及小脑部位组织，用眼科镊剥离脑 组织表面所有血管及软脑膜； 3）将处理好的大脑嵌入3﹪琼