不同浓度瘦素对乳鼠成骨细胞增殖及VEGFmRNA表达影响-外科学专业论文.docxVIP

山西医科大学 山西医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 前 言 骨损伤后的骨折愈合过程是一个极其复杂的自体修复过程，期间有多种因素的共同 作用参与。如何能促进骨折愈合过程长久以来一直是骨科医师及广大学者研究的热点问 题之一，而骨折的延迟愈合和不愈合更是骨科学界所面临的一个棘手问题，有数据表明 其发生率占到新鲜骨折的 5%。 骨折的愈合是指骨损伤后骨折断端通过骨的再生修复达到组织形态和生理功能的 完全恢复。根据细胞形态学的特征，一般主张将骨折愈合过程分为血肿形成及肉芽组织 修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板形成期和骨重建与塑形期 4 期。①血肿形成及肉芽 组织修复期：骨断裂后,骨实质及周围软组织损伤形成血肿，断端出现坏死，两者引起 局部无菌性炎症反应。吞噬细胞、多核细胞及巨噬细胞等侵入血肿,进行清除机化，同 时新生血管长入，成纤维细胞产生胶原纤维，新形成的肉芽组织将骨折断端初步连接。 ②原始骨痂形成期：此过程由膜内成骨和软骨内成骨共同参与。原始骨痂即 I 级骨单位 形成。③成熟骨板形成期：成骨细胞和破骨细胞共同作用而完成死骨的清除和爬行替代 过程，最终原始骨痂被成熟的板状骨（Ⅱ级骨单位）所代替，坚实的骨性连接形成。④ 骨重建和塑形期：受应力的影响，成骨细胞和破骨细胞作用于应力轴线以上及以外的骨 痂，进行加强、改造和清除；随后髓腔再通，正常骨形态恢复。[1] 而影响骨折愈合的因素可分为全身因素和局部因素，全身因素包括年龄、营养状态、 代谢内分泌因素（钙磷代谢受 VD3、降钙素、甲状旁腺素的调节）；局部因素则包括引 起骨折的原因、骨折的类型，骨折端的血运情况、软组织损伤的程度、软组织嵌入、感 染及神经支配，而骨折端的血运情况在局部影响因素中是极为重要的因素，血液循环好、 供应满意，愈合快；相反循环差，供应不佳，则容易发生延迟愈合、不愈合和无菌性坏 死。[2] 由上述过程可以看出，骨折愈合过程是一个复杂而高度有序的生理过程,涉及成骨 细胞的增殖、分化和迁移，细胞外基质的分泌及钙化，创伤部位新生血管网络的形成， 破骨细胞及成骨细胞对骨痂的改建等一系列有序的活动。而成骨细胞的增殖和新生血管 的生成在这个复杂的过程中起到了至关重要的作用。 随着分子生物学的发展，骨折愈合机制的研究也深入到分子水平，骨形成过程中全 身及局部的众多细胞调控因子的作用被逐步发现，这些因子大多可以通过刺激成骨细胞 的增殖和活性来促进骨愈合。瘦素最初被发现与肥胖相关，是具有调节人体摄食和能量 代谢功能的细胞因子。近年来的研究表明瘦素还在诸如骨代谢、生殖、免疫、造血、及 血管形成等多方面有调节作用[3]。血管内皮生长因子(VEGF)则早已被证明既是目前最 强力的血管生成因子，同时又是一个骨生长因子。 本实验拟通过观察瘦素对乳鼠成骨细胞增殖的影响及对血管内皮生长因子(VEGF) 表达的调控作用,来揭示瘦素在影响骨代谢过程中的作用机制,为骨损伤后的骨修复和 再生提供新的治疗方法和理论依据。 实验一 成骨细胞的分离培养及细胞鉴定 成骨细胞的体外培养有很多种方法，其培养技术已经被广泛应用。目前成骨细胞的 原代培养方法主要有两种：酶消化法和组织块法[4]。其中酶消化法因其一次可获得较多 量的细胞而被广泛采用。常用的消化酶主要为胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶。其 中胶原酶因其性质较胰蛋白酶相对温和，对细胞损伤相对较小而被受广大学者的青睐[5]。 本实验采用分步酶消化法分离乳鼠颅骨成骨细胞，通过细胞形态学观察、碱性磷酸酶染 色及矿化结节染色鉴定，以获得较多量高纯度的成骨细胞，为进一步的实验研究奠定基 础。 材料与方法 1 实验动物 六只新生24hWistar乳鼠，由山西医科大学生理教研室动物房提供。 2 主要试剂 DMEM 培养基干粉 杭州四季青生物工程材料研究所 0.25%胰蛋白酶 杭州四季青生物工程材料研究所 胎牛血清 杭州四季青生物工程材料研究所 青霉素 华北制药集团有限责任公司 链霉素 华北制药集团有限责任公司 Ⅱ型胶原酶 美国Sigma公司 β-甘油磷酸钠 美国Sigma公司 L-抗坏血酸 美国Sigma公司 茜素红 上海锐聪科技发展有限公司 3 主要仪器 1851 CO2 培养箱 TCSHE-LAB GB-Ⅱ超净工作台 北京市新技术应用研究所 台式离心机 北京医用离心机厂 XSI-D2 倒置生物显微镜 重庆光学仪器厂 4℃、-20℃电冰箱 日本 SANYO 公司 电热压力蒸气灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司 MP200-I 电子天平 上海第二天平仪器厂 细胞培养瓶