金雀异黄素对CIA大鼠关节FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究-内科学(风湿免疫)专业论文.docxVIP

张学增：Gen对CIA人鼠关节FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究金雀异黄素对CIA大鼠关节FLS增殖、凋亡 张学增：Gen对CIA人鼠关节FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究 金雀异黄素对CIA大鼠关节FLS增殖、凋亡 及其机制的实验研究 中 文 摘 要 目的： 研究金雀异黄素(genistein，Gen)对II型胶原诱导型关节炎(collagen type II induced arthritis，CIA)大鼠关节成纤维样滑膜细胞(fibroblast—like synoviocytes， FLS)增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。 研究对象： CIA大鼠关节成纤维样滑膜细胞 方法： 首先，采用II型胶原和完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)共同 建立CIA大鼠模型，对大鼠每周进行一次关节炎指数(arthritis index，AI)评分及 后肢容积测定。于造模第六周摄取关节X线片，然后处死大鼠，取大鼠后肢关节 进行关节滑膜组织病理检测，并取出关节滑膜组织，用胶原酶消化法分离培养原 代FLS；采用台盼蓝拒染法检测FLS活性，噻唑蓝(MTT)法检测Gen对FLS细 胞增殖的影响，免疫印迹(Western Blot)检测Gen作用CLA大鼠关节FLS细胞后 其凋亡蛋白bax和bcl．2的表达情况；Western Blot检测MAPK和P13K／AKT信号 转导通路中ERK、AKT和其磷酸化形式p-ERK、p-AKT蛋白的表达量。 争士电 耋口刁K： l、II型胶原致敏后三天，大鼠开始出现关节肿胀，m评分逐渐增高，至造模 后第三周最为明显。通过观察m评分、后肢容积测定、关节X线片以及关节滑膜 组织病理发现，造模组与空白对照组比较有显著性差异。表明造模成功，可满足 本实验需要。原代培养CIA大鼠滑膜细胞，培养至第4代细胞形态均一。 扬州人学硕+学位论文2、经显微镜下细胞计数板计数台盼蓝染色FLS活细胞率大于90％，活性满足 扬州人学硕+学位论文 2、经显微镜下细胞计数板计数台盼蓝染色FLS活细胞率大于90％，活性满足 实验要求。MTT结果显示，造模后CIA大鼠关节FLS增殖程度明显高于正常组大 鼠关节FLS，50、100和200州的Gen均可以显著抑制CIA大鼠关节FLS增殖， 与模型组比较有显著性差异(尸o．05)，且在不同时间段均呈剂量依赖性抑制作用。 200 o,M的Gen作用于CIA大鼠关节FLS后，其增殖程度低于正常组FLS的增殖， 其中，在72h时间段，两组比较有显著性差异(P0．05)。Western Blotting检测 凋亡蛋白水平结果显示：与正常组比较，模型组大鼠关节FLS细胞bax蛋白表达 水平明显降低，而模型组大鼠关节FLS细胞bcl一2蛋白表达水平较正常组大鼠关 节FLS细胞明显增高，均有显著性差异(P0．05)；与模型组比较，不同浓度的 Gen作用细胞后，随着药物浓度的增加，bax蛋白表达均有不同水平的上调，其中 Gen中剂量组(Gen2)和高剂量组(Gen3)与模型组比较有显著性差异(Po．05)， 低剂量组(Genl)与模型组比较无显著性差异(JPO．05)；用药组bcl一2蛋白表 达均有不同水平的下调，与模型组比较均有显著性差异(PO．05)。 3、Western blot检测MAPK和P13K／AKT信号转导通路中信号蛋白表达水平结果 显示：1)与正常组比较，模型组及用药组EKR、AKT表达量均无明显差异(尸O．05)； 模型组FLS细胞P．ERK和P．AKT表达量高于正常组，且有显著性差异(尸o．05)； 各Gen用药组FLS细胞P．ERK蛋白的表达均低于正常组，有显著性差异(尸0．05)， 且p．ERK表达的降低与Gen_呈剂量依赖性。各Gen用药组FLS细胞P．AKT蛋白的表达 均高于正常组，Genl和Gen2组与正常组比较有显著性差异(尸0．05)，Gen3组与 正常组P．AKT表达相当(胗0．05)。2)与模型组FLS比较，各用药组ERK、AKT 表达无明显差异(扮O．05)；不同浓度Gen用药组FLS细胞P．ERK、p-AKT蛋白的 表达均低于模型组，均有显著性差异(Po．05)，且p—ERK、p-AKT表达的降低与 Gen呈剂量依赖性。 结论： l、本实验CIA大鼠模型构建成功，并成功分离培养了原代大鼠关节FLS。 2、Gen能够抑制CIA大鼠关节FLS细胞的增殖，同时，可调节凋亡蛋白的表 张学增：Gen对CIA人鼠关：肖FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究达，可能通过此机制促进CIA大鼠关节FLS的凋亡，所以Gen有可能通过调节滑 张学增：Gen对CIA人鼠关：肖FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究 达，可能通过此机制促进CIA大鼠关节FLS的凋