金雀根中类雌激素成分的筛选与作用机理的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

金雀根中类雌激素成分的筛选与作用机理的研究摘要 金雀根中类雌激素成分的筛选与作用机理的研究 摘要 f雌激素对人体具有一系列有益的作用，可防治骨质疏松、心血管疾病以及老 年性痴呆等病变。女性进入绝经期以后，随着体内雌激素水平的降低，产生更年 期综合征。为了维持体内雌激素水平，运用雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy)缓解更年期综合症及防治绝经后的骨质疏松。但是，雌激素有增加乳腺 癌及子宫内膜癌发生率等不良倾向。 报导证实了某些植物来源的非甾体类化合物有雌激素样作用，还具有选择性 雌激素受体调节剂(selective estrogen receptormodulators，SERMs)的特点，如模 拟雌激素对骨组织、心血管系统、神经系统等作用，但无刺激子宫内膜增生的特 点，因此被称为植物雌激素。k 金雀根提取物中的活性部位(extract of Caragana sinica，ECS)具有微弱的雌 激素样作用，本文筛选ECS中具有类雌激素作用的有效成分，对其作用机制作进 一步研究，为其应用于临床提供药理及分子生物学依据。 一．金雀根中类雌激素成分的筛选及促细胞生长作用的研究 采用细胞增殖实验，以人乳腺癌MCF一7细胞为靶细胞，从ECS中筛选具有类 雌激素样作用的成分。 对细胞增殖实验加以改进：构建雌激素受体(estrogen receptor,ER)反义RNA表达质粒(pCASER)，转染人乳腺癌MCF一7细胞，降低 MCF一7细胞中ER的表达水平，筛选稳定转染ER反义核酸的MCF一7细胞 一MTASER，同时以MCF一7和MTASER为靶细胞进行细胞增殖实验，比较有效成 分对两种细胞增殖的影响。 跆果显示：ECS中的两种成分Miyabenol C(Miy C)和Kobophenol A(Kob A)可以促进MCF．7细胞的增殖。1713一雌二醇(t713．estradiol，E2)，金雀异黄素， Droloxifen，Miy C和Kob A在一定浓度范围内均可促进MCF．7细胞增殖，且对 MCF．7的促增殖作用大于对MTASER的促增殖作用；表皮生长因子对两株细胞的 促增殖作用的差别无显著意义。在一定的浓度范围内，Miy C和Kob A可拮抗 lnmol／1 E2诱导的MCF一7细胞的增殖。 以上结果证实从ECS中筛选出的两种成分Miy C和Kob A在一定程度上依赖 ER发挥促细胞增殖的作用，具有一定的雌激素样作用。心 二．Miyabenol C和Kobophenol A对雌激素受体的影响 为了对Miy C和Kob A的雌激索样作用进行进一步研究，J?tJ)rl放州性配体 兜廿纳台实验检测Miy C和Kob A-5 ER的结合能力；利用报告地J盈检测实验研 究MiyC和KobA对ER活性的影响；利用蛋白免疫印记技术及半定量RT．PCR 究MiyC和KobA对ER活性的影响；利用蛋白免疫印记技术及半定量RT．PCR 技术检测它们对ER蛋白质及RNA水平的影11I自。 f结果显示Miy C和Kob A可与ER结合。利用MCF．7细胞的全细胞蛋白进 行放射性配体竞争结合实验，结果显示它们对’H．E2与ER结合的半效抑制浓度 在“mol／l水平：但在商浓度时促进’H—E2与ER的结合。在MCF一7细胞中进行 放射性配体竞争结合实验，Miy C对‘H—E2与ER结合的半效抑制浓度增加。它 们随浓度增加激活ER，使之促进下游基因转录；Miy C在高浓度时与E2协同激 活ER。它们可下调ER在MCF．7细胞中的蛋白与RNA水平。 以上结果证实Miy C和Kob A在多方面表现雌激素样物质的功能。同时， 它们同时具有的非激素样作用也可影响ER的功能。＼、 7＼ 三．Miyabenol C和Kobophenol A防治骨质疏松作用机制的初步研究 为了研究Miy C和Kob A的选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptormodulators，SERMs)的性质及其在防治骨质疏松中的机制，运用MTT实 验，检测它们对类成骨细胞和子宫内膜癌细胞增殖的影响；以及半定量RT—PCR 技术检测它们对IL．6基因转录水平的影响。 f结果显示MiyC和KobA对大鼠的类成骨细胞有促增殖作用；对子宫内膜 癌细胞无促增殖作用；使IL-6的mRNA水平降低。 以上结果证实Miy C和Kob A具有SERMs的特点，具有防治骨质疏松的 作肌立 四．Miyabenol C和Kobophenol A与雌激素受体结合位点 为了探讨Miy C和Kob A与ER的结合部位，运用计算机辅助分子模拟， 构建它们与ER结合的空间模型，找出结合位点，设计ER的两个突变体[M1ER (ERM517AG521D)和M