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分析引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其流行特征和血清型 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：分析引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其流行特征和血清型 1 1、材料与方法 2 2、结 果 4 3、讨 论 6 文2：新生儿病室轮状病毒肠炎流行特征和检验效果 7 1资料与方法 9 2 结果 10 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 分析引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其流行特征和血清型 文1：分析引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其流行特征和血清型 肠道病毒(enterovirus，EVs)为小RNA病毒科肠道病毒属单正链RNA病毒，主要有脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(Echovirus)和新型肠道病毒EV68～EV71[1]。EVs通过肠道感染，但往往引起肠外疾病，如支气管炎和肺炎、手足口病、心肌炎、心包炎和脊髓灰质炎等，但以儿童呼吸道感染最为常见[1，2]。此外，EVs血清型众多，不同血清型地域分布及其所致疾病有明显差异[3，4，5，6]。众所周知，包括我国在内的不少国家和地区流行EV71和一些柯萨奇病毒血清型感染所致的手足口病，但近年来EVs引起的儿童呼吸道感染性疾病发病率不断升高，引起国内外广泛关注[7，8，9，10，11]。所有EVs具有衣壳蛋白VP1，但不同EVs及其血清型VP1序列可有明显差异，故VP1基因不仅用于EVs分类参考，也作为血清型分类依据[12]。本研究中，我们采用VP1基因通用引物的实时荧光定量RT-PCR检测了2 164例呼吸道感染患儿标本中EVs，阳性标本采用EVs VP1/VP3基因通用引物的套式RT-PCR扩增后测序分型，以了解本地区儿童呼吸道感染性疾病的优势EVs及其主要血清型和流行特征，为此类疾病临床诊治提供参考。 1、材料与方法 一般临床资料 采集2016年1月至2018年12月杭州地区多家门诊或住院2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本，其中男性患儿1 297例、女性867例，患儿最大年龄13岁、最小34 d，中间年龄3岁。 主要仪器与试剂 RNA病毒核酸提取试剂盒(湘长械备)和EVs核酸检测试剂盒(国械注准)购自湖南圣湘生物科技有限公司。实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产的ABI-7500型。电泳仪和凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。 方法 按照病毒核酸提取试剂盒的说明书，采集咽拭子置于标本保存液中，充分震荡混合后取200μL移入 mL灭菌试管中，加入600μL提取液-1震荡混匀，瞬时离心后加入100μL提取液-2震荡混匀，室温静置30 min，瞬时离心后将试管置于分离器上，静置3 min后吸弃分离液，加入600μL提取液-3和200μL提取溶液-4震荡混匀，瞬时离心后将试管置于分离器上，静置3 min后吸弃分离液，加入30μL RNA洗脱液，混匀后室温静置5 min，将离心管置于分离器上静置3 min，吸取洗脱液即为病毒RNA提取物，置—70℃备用。 -PCR 按照EVs核酸检测试剂盒说明书，每管加入实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)反应液43μL、酶混合液2μL、病毒RNA模板5μL，然后在实时荧光定量PCR仪上检测。反应条件:95℃1 min、50℃30 min逆转录;95℃1 min，95℃15 s、60℃30 s，共45个循环进行扩增。 EVs分型 参照文献[13]合成EVs VP1/VP3区通用分型测序引物(表1)。qRT-PCR检测EVs核酸阳性标本进行套式PCR(Nested-PCR)扩增。采用通用引物224/222进行逆转录和第1次PCR扩增，反应参数:95℃1 min、50℃30 min逆转录;95℃5 min，95℃15 s、55℃45 s、72℃30 s，共45个循环进行扩增。以5μL第1次PCR产物为模板，采用通用引物AN89/AN88进行第2次PCR扩增，反应参数:95℃1 min，95℃15 s、55℃45 s、72℃30 s，共30个循环进行扩增。用溴乙锭预染色%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，委托泰和永昌(长沙)生物技术有限公司采用双脱氧末端终止法测序。测序结果在GenBank数据库中的序列进行Blast比对，获得EVs种类及其分型结果。 表1 EVs套式PCR扩增引物 EVs基因种系发生分析 参照文献选择GenBank中代表性参考序列[13]，上述EVs VP1/VP3区测序并EVs种类及其分型结果的每条序列采用软件默认参数进行多序列比对，采用Mega 软件和Neighbar-Joining法构建种系发生进化