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大规模猪场非洲猪瘟预防检测方案设计 1.选题背景 随着社会的极速发展，人们对于生活质量的需求日渐增加，猪肉作为我国人民餐桌上最重要的动物性食品，它的消耗量巨大，随之的繁殖场也日益增多，猪肉的生产管理日渐从散户到猪场管理，而随着大规模的养殖，人民也开始担心疾控问题，成熟的大规模猪场已经会本厂开始针对猪常规病原开展检测防疫工作，而非洲猪瘟作为急性感染死亡率100％的一类动物疫情，到目前为止还没有专门针对非洲猪瘟的抗病毒药物或者是特效疫苗，不可以有效的在疫情爆发时及时控制病毒的传播，只能依靠监测预防，本文是根据实验室检测相关内容对于非洲猪瘟进行描述以及大致的用监测来预防非洲猪瘟。 2.非洲猪瘟的背景 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（又称为:ASFV）感染家猪、各类野猪（例如欧洲野猪、非洲野猪等）然后引起的一种会出现急性的出血性的烈性的传染病。病猪一般会有如食欲减退、无精神、发烧、呼吸困难等一系列症状，在鼻子、耳朵等相应部位也会有紫斑。实验室用p72基因来检测非洲猪瘟病毒。 非洲猪瘟病毒一般按基因分为野毒和疫苗毒珠，疫苗毒是直接就使用白瓶疫苗，造成疫苗毒株会在猪体内毒力返强而发病的毒珠；野毒就是非洲猪瘟病毒本身；非洲猪瘟野毒与疫苗毒一般是需要检测3个基因来区分它们的，比较常监测的位点是CD2v基因或MGF360 基因，如果是野毒的话这些基因都会为阳性，疫苗毒的话都是为阴性。因为目前临床上还没有大量商业化应用区分这两张毒珠感染的抗体，对于我们猪场大规模检测而言成本过高。而这两种毒珠之间本身具有一定的抗原差异，相对抗体检测来说更经济实用。因我所在猪场实验室所使用的鉴别非瘟毒珠的引物为MGF，所以下文引物都默认为MGF引物鉴别。 3.非洲猪瘟的病原检测方法 现在我们实验室普遍采用的检测技术是实时荧光定量PCR技术 （也称为qPCR），PCR是QPCR的前身，这是指将提取样本中的微量的DNA模板放大后来研究模板的特性，PCR技术是通过凝胶电泳EB染色或者通过同位素标记定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模板拷贝数。 实时荧光定量PCR技术就是在PCR反应体系中会加入荧光基团（是荧光染料或者荧光标记的探针），随着PCR反应的持续进行，PCR产物不断的复制累积，荧光信号强度会等比增强，每经过一个循环，便会收集一个荧光强度的信号，仪器会通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而得到一条完整的扩增曲线。利用这个荧光信号积累来实时检测整个PCR的进程，最终通过这条标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物的荧光信号的实时监测，从而对起始模板定性及定量的分析。 实时荧光定量PCR技术它实现了对DNA模板的定量，而且具有特异性强、灵敏度高和可靠性强，自动化程度高，无污染等突出优势，也因此被公认为是当今世界用于临床的最先进的核酸分子诊断技术。 因为PCR技术只能复制引物，而荧光定量PCR技术可以直接判读阳性以及后续的区别毒珠工作，所以主流市场都已经淘汰PCR技术，使用荧光定量PCR技术。 4.非洲猪瘟病原检测流程 4.1采样标准 这边猪厂送样采样的方法一般包括棉签（用于猪只的口鼻拭子采样）、纱布（用于人员、车辆、环境采样）、抗凝管（采血）。在采样的过程中，要求采样人员要注意勤更换手套，避免出现交叉污染。因为采样部分本身就具有概率属性，所以在采样的时候我们会要求重点照顾发病的栋舍，栋舍内的死角，猪群、人员、车辆与物资现在或者曾经频繁交叉出现的地方。 4.2样本的接收与处理 接收的样本类型一般包括一些拭子（环境拭子、人员拭子、车辆拭子、猪拭子），血清，全血，粪便，乳汁组织，精液小样。组织样品处理是选择有病变的组织，组织需要用灭菌剪刀剪碎后将它放入无DNA/RNA酶的PE管中，然后用组织研磨仪破碎，再加入1ml生理盐水，将它离心，取上清液待测。 4.3核酸提取 目前我们大部分实验室是使用核酸提取仪来提取的核酸，核酸提取仪大多是以磁珠为载体，然后通过转移液体或者移动磁珠来实现核酸的完整的提取纯化过程。核酸提取仪它有非常多的通量，一般是可以提取5-96个样本，并且操作非常的简单快捷，提取96个样本大概只需要45分钟，相对于手提核酸来说既保证了实验质量，又节省了人工成本，时间成本，大大提高了实验的效率。因为都是同一批次的核酸提取仪提取，为了监控核酸提取仪，在每一台核酸提取仪，每批次实验中都应该加入阴阳性对照来作为质控。 4.4配制QPCR反应体系 将探针、上下引物按要求进行等比稀释，混合配置成为引物原液，将它放入棕色管内避光低温保存，然后将引物原液按照要求来稀释成引物稀释液，根据检测数量来配置相应的扩增液。将配置好的PCR扩增液封装置没有核酸酶的反应管中。把提取好的核酸模板加入已分装有PCR扩增液的反应管中，盖好管盖，