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金属内酰胺酶imp基因的pcr方法研究 金属脲-内酰胺酶（金属-内酰胺），简称金属酶，是一种广泛水解换化的酶。它不受托吡鲁坦等-内酰胺酶抑制剂的影响。这种酶细菌-所有-内酰胺抗生素、碳青霉烯类-烯酸盐等-内酰胺抗生素的影响，以及临床治疗中的困难。本研究建立了检测金属酶IMP基因的PCR法, 现将方法和结果报告如下。 1 1.1 材料表面 1.1.1 耐亚胺培南细菌的分离和鉴定 实验所用的菌株来自本院2002年1月～2003年3月临床分离的耐亚胺培南细菌27株, 其中铜绿假单胞菌21株、不动杆菌属2株、嗜麦芽窄食单胞菌4株。 1.1.2 atcc603 大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603, 购自卫生部临床检验中心;产IMP-1金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌由浙江大学医学院附属第一医院传染科俞云松教授惠赠。 1.1.3 培养基与药物敏敏纸 分别购自中国药品生物制品检定所和北京天坛生物制品所。 1.1.4 2-氨基丙酸 购自美国ACROS ORGANICS公司, 批号A015645601。 1.1.5 生物饲料 购自上海博亚生物技术公司。 1.2 方法 1.2.1 细菌的培养和鉴定 细菌培养根据临床检验操作规程按常规方法进行, 鉴定采用VITEK-32全自动微生物鉴定系统鉴定结果。 1.2.2 抗生素敏感试验 采用纸片扩散法 (K-B法) , 按NCCLS 1999标准操作及判断结果 1.2.3 细菌金属酶的检测 参照文献 1.2.4 imp基因模板液的制备 挑菌落少许置入内含50 μl裂解液 (0.5%非离子去污剂NP40配制的400 μg/ml蛋白酶K) 中, 置55℃水浴消化1 h, 改置95℃水浴灭活10 min, 15 000 r/min 30 s, 上清液即为IMP基因模板液。 1.2.5 基因共聚合酶基因t-pcr扩增 从美国国立生物信息中心 (NCBI) [网址:/]检索全部已登录的IMP基因各亚型序列, 自行设计兼并引物P1:5′-CGG, CC (G/T) , CAG, GAG, (A/C) G (G/T) , CTT, T-3′, P2:5′-AAC, CAG, TTT, TGC, (C/T) TT, AC (C/T) , AT-3′。反应体系为:P1和P2各0.5 μmol/L, dNTPS各200 μmol/L, KCL10 mmol/L, (NH 2 菌株1菌株鉴定法 27株耐亚胺培南细菌金属酶表型共检出产金属酶菌株8株, 其中铜绿假单胞菌7株、嗜麦芽窄食单胞菌1株。 对产IMP-1金属酶铜绿假单胞菌及27株耐亚胺培南临床分离菌的模板DNA进行扩增后, 7株表型产金属酶铜绿假单胞菌IMP基因扩增阳性, 均扩增出587 bp的条带, 其他扩增均阴性。 3 pcr检测及结果 细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类, 但也有一小部分活性部位为金属离子的酶类。1989年Bush等 由于不同种IMP基因的氨基酸序列一致性都在85%以上, 因此可设计兼并引物能扩增多种IMP基因亚型。本研究利用PCR方法检测了27株耐亚胺培南临床分离菌的模板DNA进行扩增, 7株表型产金属酶铜绿假单胞菌IMP基因扩增阳性, 均扩增出587 bp的条带, 其他扩增均阴性。1株表型产金属酶嗜麦芽窄食单胞菌扩增阴性, 这是由于嗜麦芽窄食单胞菌产生的是L-1型金属酶。该方法具有灵敏度高, 特异性好的优点, 而且可以有效识别沉默型或可诱导表达基因的潜在耐药株, 有利于耐药菌株的监控。