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培美曲塞联合舒尼替尼对肝癌sk-hep1细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响 肝癌是一种常见的胃肠道疾病，其死亡率低于癌症和食管。2015年的数据显示, 肝癌在我国的新发病例约有40万, 占全世界的50%以上, 严重影响着我国人民的身体健康和生活质量 1 材料和方法 1.1 细胞凋亡和细胞凋亡检测 肝癌SK-Hep1细胞购于中科院上海细胞库, 培美曲塞和舒尼替尼购于齐鲁制药公司, RPMI-1640培养基、胎牛血清、噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜和胰蛋白酶均购自美国Sigma公司, 蛋白激酶B (AKT) 一抗、磷酸化蛋白激酶B (p-AKT) 一抗、增殖细胞核抗原 (PCNA) 一抗、B淋巴细胞瘤-2基因 (Bcl-2) 、切割型半胱天冬酶3 (Cleaved caspase-3) 一抗、内参β肌动蛋白 (β-actin) 和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗均购于美国Cell Signaling公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒均购于上海碧云天公司。酶标仪购自美国Bio Rad公司, 流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司。 1.2 细胞培养 解冻复苏后的SK-Hep1细胞, 以含有血清的RPMI-1640完全培养液培养在含5%CO 1.3 细胞移植试验 取对数生长期的SK-Hep1细胞, 按照2.5×10 1.4 细胞周期和死亡实验 取6孔细胞板, 将对数生长期的SK-Hep1细胞, 以每孔2 ml (浓度为2.0×10 1.5 蛋白检测试验 将培养72 h后的对照组、培美曲塞组、舒尼替尼组和联合组细胞, 在冰上加RIPA裂解液, 离心收取上清液, 将获得总蛋白以BCA蛋白检测试剂盒进行定量。再经沸水浴变性后的蛋白样品滴加到10%SDS凝胶孔中电泳, 分离结束后, 以电转印至PVDF膜上, 并置于TBST封闭液 (含5%脱脂牛奶) 中常温封闭2.5 h。分别加入一抗 (4℃下反应24 h) 和HRP标记二抗 (37℃下反应2 h) 孵育后, 以ECL试剂显色, 凝胶图像处理系统拍照并分析。 1.6 统计分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差 2 结果 2.1 mtt法检测细胞的生长抑制率 分别将浓度为0、0.625、1.25、2.5、5和10μmol/L的培美曲塞和浓度为0、0.5、1、2、4和8μmol/L舒尼替尼作用于肝癌SK-Hep1细胞, MTT法检测细胞的生长抑制率, 结果见表1和表2。培美曲塞和舒尼替尼均能够呈时间-浓度依赖性抑制SK-Hep1细胞增殖, 培美曲塞在24、48和72 h下的IC 为了进一步探讨两药联用后的协调作用, 选取2.5μmol/L培美曲塞和2μmol/L舒尼替尼单用及联合作用于SK-Hep1细胞, 进行后期实验。结果发现, 与培美曲塞组和舒尼替尼组相比, 联合组对SK-Hep1细胞增殖的抑制率明显升高 (P0.05) , 见表3。 2.2 perrin和schruni对肝肿瘤细胞周期的影响 与对照组相比, 培美曲塞组中G 2.3 细胞凋亡率 与对照组相比, 培美曲塞组、舒尼替尼组和联合组中细胞的凋亡率均显著升高 (P0.05) ;与培美曲塞组和舒尼替尼组相比, 联合组中细胞的凋亡率也显著升高 (P0.05) , 见图1和表4。 2.4 培美曲塞和舒尼替尼对三种蛋白表达的影响 在对照组、培美曲塞组、舒尼替尼组和联合组中AKT的表达水平无显著变化, 但培美曲塞组、舒尼替尼组和联合组中p-AKT、PCNA、Bcl-2的表达均显著下降 (P0.05) , 与对照组相比, 差异均有统计学意义 (P0.05) , 且联合组中的三种蛋白的表达水平明显低于培美曲塞组或舒尼替尼组 (P0.05) ;同时, 与对照组相比, 培美曲塞组、舒尼替尼组和联合组中Cleaved caspase-3的表达均明显升高 (P0.05) , 且联合组中的表达水平也显著高于培美曲塞组或舒尼替尼组 (P0.05) , 见图2和表5。 3 时间-浓度依赖性抑制剂对k-hep1细胞增殖的影响 酪氨酸激酶抑制剂正逐渐成为一种新型抗肿瘤药物, 越来越备受关注。舒尼替尼是治疗肾癌和胃肠道肿瘤的多靶向性酪氨酸激酶抑制剂 研究结果显示, 舒尼替尼和培美曲塞均能够呈时间-浓度依赖性抑制肝癌SK-Hep1细胞增殖, 同时, 培美曲塞和舒尼替尼也均能够诱导SK-Hep1细胞凋亡。这一结果与Lahti S等 PCNA是一种参与DNA合成的DNA聚合酶的辅助蛋白, 也是细胞从G 综上所述, 培美曲塞联合舒尼替尼可抑制SK-Hep1细胞增殖, 并诱导SK-Hep1细胞周期阻滞和凋亡, 其作用机制可能与下调p-AKT、PCNA、Bcl-2表达和上