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克氏原螯虾染色体及其核型的研究 克氏原始指令虾，俗称小龙虾，但在分类上不属于palinuridae，属于i类saltin，属于coltier。克氏原螯虾原产于美国东南部, 特别是密西西比河路易斯安那州, 最初作为饲料来源引种到日本, 20世纪又由日本引进中国, 并迅速在我国上海、江浙、安徽、湖北等地扩展[1]。克氏原螯虾具有生长速率快、养殖周期短、肉质鲜美等优点, 现已成为我国重要的淡水养殖品种。因此, 开展克氏原螯虾染色体研究可为遗传改良及新品种培育提供基础资料。 至今国内外的学者已对近100种十足目 (Decapoda) 甲壳动物的染色体数目进行了研究, 大多数报道集中在对虾科 (Penaeidae) [2-5]和长臂虾科 (Palaemonidae) 由于甲壳动物染色体数目庞大, 而且细胞有丝分裂指数低, 进行染色体的核型分析比较困难, 因此核型方面的研究报道很有限。本实验利用常规空气干燥法制备克氏原螯虾精巢细胞染色体标本, 采用Giemsa和DAPI两种染色方法, 获得了清晰的精巢细胞有丝分裂和减数分裂中期分裂相, 对其进行了数目统计及初步核型分析。 1 材料和方法 1.1 果园发挥空间 克氏原螯虾购自上海浦东新区临港新城芦潮港镇果园农贸市场。暂养于实验室的水族缸中。每天给予其充足的氧气以及新鲜的食物, 保证其生命活力。 1.2 细胞悬液的制备 染色体的制备 (1) 秋水仙素处理:向克氏原螯虾第二步足侧夹缝中注射浓度为0.01%的秋水仙素, 注射剂量为10μg/g虾体质量。注射后暂养2~4 h。 (2) 采样:解剖取出克氏原螯虾的精巢于生理盐水中剪碎。 (3) 低渗:将剪碎后的组织1 000 r/min离心10 min, 吸去上清液。加入75 mmol/L的KCl低渗液, 低渗时间为1 h。 (4) 固定:1 000 r/min离心10 min, 去除上清液。加入新配的卡诺固定液 (甲醛∶冰醋酸=3∶1) , 固定0.5 h, 1 000 r/min离心10 min, 吸去上清液加入新的固定液, 重复3次。最后将新加入固定液的细胞悬液置于–20°C, 过夜处理。 (5) 解离:–20°C中取出已经固定好的细胞悬液, 离心去上清液 (同上) 。加入50%的冰醋酸2~3滴进行细胞解离后, 加入新配的卡诺固定液。 (6) 滴片:将细胞悬液滴在载玻片上 (载玻片提前冷冻在–80°C冰箱中) , 滴片的高度为1~2 m。 (7) 干燥:立刻将滴有细胞悬液的载玻片置于酒精灯下烘烤, 一边用嘴吹气使细胞完全分散。 (8) 染色:将载玻片置于Giemsa染缸中 (p H=7.0的磷酸缓冲液配制) 染色15 min, 用清水冲洗干净, 或者将载玻片进行酒精梯度脱水后用DAPI染色8 min。 (9) 观察:将染色体标本置于显微镜下观察、拍照。 染色体的核型分析选取了76个细胞分裂中期分裂相清晰的染色体图片进行数目统计以及核型分析。 2 结果 2.1 期、粗线期及分裂相 实验选取克氏原螯虾的精巢组织制备染色体标本, Giemsa和DAPI染色后, 在显微镜下观察到了清晰的精原细胞有丝分裂和精母细胞减数分裂Ⅰ中期的分裂时相以及精母细胞减数分裂细线期/偶线期、粗线期的分裂相。克氏原螯虾精原细胞有丝分裂中期的染色体形状大多呈X型, 为中部着丝点染色体 (图1-a) , 精母细胞减数分裂中期二价体为短棒状 (图1-b) 。减数分裂细线期/偶线期发生同源染色体的联会过程, 形成二价体, 二价体呈细丝状相互缠绕在一起 (图1-c) , 无法辨认出是细线期还是偶线期。粗线期二价体变粗 (图2-a) , 呈长条状, 每条二价体上有染色较深的颗粒状小点, 为异染色质 (箭头) 部分 (图2-b, c) 。在显微镜下观察克氏原螯虾的精巢细胞染色体标本可以发现大多数分裂相处于减数分裂时期, 证明了细胞分裂的同步性。 2.2 克氏原螯虾染色体核型 克氏原螯虾染色体分裂相共76个, 其中50个为精母细胞减数分裂时期, 26个为精原细胞有丝分裂时期。对染色体数目及出现的频率进行了统计, 其中初级精母细胞二价体数目N=94出现了28次, 占总数的56%, 2N=188出现了20次, 占有丝分裂精原细胞个数的77% (表1) 。结果显示, 克氏原螯虾二倍体染色体数目为2N=188, 单倍体数目N=94。由于精原细胞有丝分裂染色体微小, 核型分析困难, 实验对精母细胞减数分裂中期二价体做了初步的核型分析 (图3) , 根据着丝点的位置将克氏原螯虾减数分裂二价体分为3组:A组 (1~55号) 共有55条, 可以清楚地辨别着丝点的位置, 为中部着丝点二价体;B组 (56~77号) 共有22条, 为亚中部或者亚端部着丝点二价体;C组 (77~94号) 共有1