温中健脾、清热吸湿法对nbs无水乙醇诱导的溃疡性结肠炎大鼠及occludin蛋白的影响.docxVIP

温中健脾、清热吸湿法对nbs无水乙醇诱导的溃疡性结肠炎大鼠及occludin蛋白的影响 溃疡性胃炎（iuc）是由基因、免疫、心理、环境等多种因素引起的肠球菌疾病。临床上主要是粘膜脓性大便、腹痛和急性腹痛。 1 材料和方法 1.1 北京生物技术有限公司 SPF级健康雄性SD大鼠70只, 体质量 (200±20) g, 购自斯贝福 (北京) 生物技术有限公司, 许可证号:SCXK (京) 2016-0002, 饲养于北京中医药大学SPF级动物房, 12 h/12 h光照/黑暗循环, 温度 (22±2) ℃, 湿度50%~60%, 自由饮食饮水。 1.2 颗粒及用药 清肠温中浸膏方 (黄连6 g, 炮姜10 g, 三七6 g, 木香6 g, 炙甘草6 g等) 由北京中医药大学中药学院提供。阳性对照中药乌梅丸 (乌梅16 g, 细辛6 g, 干姜10 g, 黄柏6 g, 桂枝6 g, 黄连16 g, 当归4 g, 附子6 g, 川椒4 g, 人参6 g) , 购自北京中医药大学东方医院颗粒剂药房。阳性对照西药美沙拉秦缓释颗粒 (艾迪莎, 国药准字 , 购自北京中医药大学东方医院药房;5%TNBS (w/v) (P2297) 购自美国Sigma公司。4%多聚甲醛、无水乙醇购自中农博信 (北京) 科技有限公司;Anti-Occludin (ab31721) 抗体购自美国Abcam公司。 1.3 各组患者的生药/剂量、清肠温中方中剂量和剂量对各组生药/剂量的影响 SD大鼠适应性饲养1周, 采用随机数字表法将70只大鼠随机分为空白组、模型组、清肠温中方高剂量组 (2.0 g浸膏/kg) 、清肠温中方中剂量组 (1.0 g浸膏/kg) 、清肠温中方低剂量组 (0.5 g浸膏/kg) 、美沙拉秦组 (400 mg/kg) 和乌梅丸组 (8.4 g生药/kg) 共7组, 每组10只。采用2, 4, 6-三硝基苯磺酸 (TNBS) /无水乙醇改良复合法复制UC模型 1.4 各组患者的清肠温中浸膏/剂量单 实验第4日起, 除空白组外, 所有大鼠连续10 d以相应药物灌胃干预 (1 m L/100 g) , 清肠温中浸膏方高、中、低剂量组分别以2.0 g浸膏/kg (临床患者2倍用量) 、1.0 g浸膏/kg (临床患者用量) 、0.5 g浸膏/kg (临床患者0.5倍用量) ;美沙拉秦组以400 mg/kg (临床患者用量) ;模型组以蒸馏水灌胃。 1.5 远端结肠叶片的诱导表达 实验期间每日记录大鼠体质量, 观察一般情况和便质, 化验便潜血。实验第14日以10%水合氯醛 (0.4 m L/100 g) 腹腔注射麻醉大鼠, 在装有碎冰的培养皿中迅速进行全结肠截取, 将骨盆剪开彻底暴露盆腔, 从肛门到膨大的回盲部全部取出, 于PBS缓冲液中迅速涮洗并纵向剖开, 根据CDMI评分标准进行评分。分离远端结肠 (距肛门10 cm) 2 cm, 于4%多聚甲醛溶液固定, 石蜡包埋切片, 片厚4μm, 抗原修复后采用DAB显色法免疫组化染色观察Occludin蛋白表达。采用Image J软件 (1.37c NIH, USA) 对染色结果进行分析计算, 平均光密度值 (AOD=Int Den/Area) 表示目标蛋白的具体染色情况。 1.6 观察指标 1) 疾病活动指数 (DAI) 1.7 统计学处理 应用SPSS22.0 (IBM, USA) 统计软件。符合正态分布的计量资料以 (ue0af±s) 表示, 用单因素方差分析进行检验, 方差齐用LSD法, 不齐用T 2 结果 2.1 各组大鼠一般情况比较 模型复制期间, 除空白组大鼠外, 均出现潜血阳性情况, 后期逐渐出现血便表现并持续天数较长, 可同时伴有粪便不成形或淡黄色黏液果胶形状, 症状持续至停药后2~3 d。严重者肛门因便血量大、血液凝固后肛周皮毛潮湿、色黑, 大鼠精神状态低下, 蜷缩抱团, 部分大鼠可见不自主颤栗现象。结合下利脓血、肛周潮湿以及畏寒抱团的大体症状, 考虑该方法复制的大鼠UC模型, 符合寒热错杂证。 随后清肠温中方中剂量组、美沙拉秦组和乌梅丸组大鼠逐渐呈现好转情况, 血便减少或消失, 粪便逐渐成形, 一般状态较前好转, 食欲增加。体质量变化率方面, 几组之间尚不存在统计学差异。便潜血和便质情况上, 模型组评分均明显高于空白组 (P0.01) ;而与模型组比较, 清肠温中方中剂量、美沙拉秦和乌梅丸组大鼠评分均有所降低 (P0.05) , 以上结果见表1。实验期间空白组大鼠无死亡, 模型组死亡4只, 清肠温中方高、低剂量组各死亡3只, 清肠温中方中剂量组、美沙拉秦组和乌梅丸组各死亡2只。 2.2 各组大鼠一般情况比较 见表2。随着模型复制的进行, 所有造模大鼠体质量均呈明