浙江部分地区猪链球菌分布及耐药情况调查.docxVIP

浙江部分地区猪链球菌分布及耐药情况调查 作为中国人饮食结构的重要组成部分，猪的安全与消费者的直接利益密切相关。据统计,2006年杭州市生猪总屠宰量约为150万头,其中30%来源于本省的萧山、诸暨、江山、德清、建德等地;50%来源于河南省,20%由安徽省、江苏省、山东省和东北三省等供应。近年来,随着养猪业的快速发展,包括猪链球菌病在内的各类疾病的发生率有一定的上升趋势,不仅给养猪业造成了极大的损失,也给猪肉的安全供应带来了隐患。尤其是2型猪链球菌,它不仅可引起猪发生败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等症状,也可以传染给人,导致人感染并死亡,是一种重要的人畜共患病病原。本研究通过对待宰猪中猪链球菌的分离及其耐药性监测,旨在了解生猪中猪链球菌的分布和饲养过程的用药情况,为防控该病提供理论依据,也为进一步保障相关从业人员的健康奠定基础。 1 材料和方法 1.1 质控菌肺炎球形atcc49重 猪链球菌2型5995株由丹麦国立兽医研究所Anderson K博士惠赠;质控菌肺炎链球菌ATCC49619由中国兽医药品监察所张纯萍赠送;BHI培养基购自OXOID;一次性接种环购自广东环凯生物科技有限公司;M-H培养基、微量发酵管和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司。 1.2 采样时间 2006年9月6日至2006年12月5日,共抽检290份屠宰场待宰生猪样品。 1.3 采样方法 将无菌一次性接种环伸到猪喉头深部,蘸取喉头黏液,立即参照文献和文献接种于配制的选择性培养基上,37 ℃培养48 h。 1.4 细菌的分离和鉴定 1.4.1 分离培养抗混血菌 在初次分离的每个培养皿中挑取针尖大小、边缘整齐、略带灰白色和呈明显的α或β溶血的菌落3个～4个,转接至含50 mL/L绵羊血的BHI平板,经37℃培养24 h～36 h,再在每个平板中挑取1个～2个可疑菌落,转接至含20 mL/L小牛血清的BHI肉汤中,37 ℃振荡培养12 h左右。 1.4.2 涂片镜检查 液体纯培养物革兰氏染色后镜检,将形态与标准菌株5995形态相似的可疑菌株进行PCR和生化鉴定。 1.4.3 猪链球菌株的构建 该检测体系由本实验室建立(已申请国家发明专利),针对猪链球菌种型特异的gdh、mrp、cps2J基因设计引物,可以同时鉴别猪链球菌和其中的2型猪链球菌。 1.4.4 分离株的鉴定 对经PCR鉴定gdh阳性或gdh、mrp和cps2J阳性的分离菌进行生化鉴定,验证分离株是否为猪链球菌。将液体纯培养物分别接种于各微量发酵管,37 ℃培养36 h观察结果。 1.5 菌落pbs的稀释 采用纸片法进行。按照美国临床试验室标准化委员会(NCCLS)推荐的方法进行。挑取生长良好的单个菌落3个～5个,用0.01 mol/L PBS稀释,调整菌液浓度至0.5麦氏单位。15 min内用灭菌棉花拭子均匀涂抹在50 mL/L羊血M-H琼脂平板上,迅速贴上阿莫西林、氨苄西林、先锋Ⅴ头孢他啶等19种药敏纸片,37 ℃培养12 h～24 h,判定结果。 2 结果 2.1 猪链球菌的3型 从表1可见,待宰猪中猪链球菌总的携带率为13.1%(38/290),猪链球菌2型为0.6%(2/290)。分离株主要来源于义乌、萧山和河南等地,其中来源于江山地区猪的猪链球菌携带率为0,而来源于义乌地区猪的猪链球菌携带率较高,为21.0%。 2.2 zjxs333的扩增结果 PCR鉴定(图1),参考菌株5995及2型分离株ZJXS026、ZJXS033均可扩增到688、532、459 bp 3条清晰的目的条带,非2型分离株均只能得到688 bp的清晰条带;生化试验验证(表2),与PCR鉴定结果基本一致。 2.3 体外耐药性结果 根据NCCLS推荐的兽医病原菌抑菌圈直径判定标准判定结果(表3)。结果表明,38株分离株对青霉素类和头孢类药物敏感,对四环素、强力霉素、红霉素、麦迪霉素和克林霉素耐药菌株的比率分别为92.1%、92.1%、57.9%、81.6%和65.8%,说明存在多重耐药性现象。各地区分离株的耐药性基本一致。质控菌株ATCC49619抑菌圈直径范围与其标准范围相同,表明试验结果成立。 3 猪链球菌致病性的调查和预防 通过对待宰猪采样检测,结果表明猪链球菌总的携带率为13.1%(38/290),2型猪链球菌的分离率为0.6%(2/290),限于试验条件,其他猪链球菌的血清型有待进一步测定。从携带猪链球菌的待宰猪来源地分析,不同产地待宰猪的携带情况存在较大差异,这可能与当地的饲养管理水平和防治措施等有关。 猪链球菌为条件致病菌,可分为35个血清型,尤其是猪链球菌2型,它主要通过直接接触或污染环境进行水平传播,通常从口腔、鼻腔或伤口等侵入机体,从而导致人或动物的感染。Chang B等对1994年-2006年间日本发生的