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柳杉凋落物的自毒作用及其对天然更新的影响 中毒的作用被认为是影响森林太新的重要因素之一。目前,对于森林自毒作用的研究主要集中于北方森林,对南方森林的研究较少。在对南方森林进行调查的过程中,作者发现,柳杉Cryptomeria fortunei林的天然更新状况与受自毒作用影响的北方针叶林的更新状况非常相似:天然更新成功率几乎为0,仅林窗中偶有发生。这是否意味着柳杉林同样也遭受着自毒作用的困扰呢?柳杉不仅是中国南方主要用材树种之一,也是中国特有树种。尤其是浙江天目山国家级自然保护区的柳杉林,历史悠久,植株高大,形成了世界罕见的大柳杉群落,其中胸径超过50 cm的柳杉达2 032株,占总数的37%,天目山因此也获得了“大树华盖闻九州”的美誉。因此,对柳杉林的自毒作用进行研究,并选择天目山柳杉林作为试验地,对南方森林的天然更新研究和柳杉这一珍贵树种遗传基因的保护都有着重要意义。前期调查发现,天目山柳杉种子主要落在其枯枝落叶层和腐殖质层。凋落物又是自毒物质的主要来源之一。因此,从柳杉凋落物的自毒作用入手进行探索。柳杉球果成熟时间为10-11月,种子萌发为翌年的3-4月。这一期间是化感物质对种子产生影响的重要阶段,所以本研究选择2006年10月至2007年4月为研究时间。 1 材料和技术路线 1.1 材料和实验方法 在天目山柳杉林中按文献的方法取样。取样后混合带部分回实验室冷藏备用。收集样品分3个部分:未分解凋落物、半分解凋落物和表层土壤(0~5 cm)。在相同样地中,以同样方法收集1次·月-1。收集时间为2006年10月至2007年4月。 柳杉种子采自浙江天目山国家级自然保护区,4℃冰箱中保存。 仪器:Waters 600E高效液相色谱仪,恒温培养箱。 试剂:阿魏酸,肉桂酸,对羟基苯甲酸对照品。 1.2 绝干含水率 采回的样品取部分称量,然后放入烘箱中80℃烘至恒质量,再称量,计算含水率,计算公式:绝干含水率=(湿质量-绝干质量)/绝干质量×100%。 1.3 提取物和培养基溶液的制备 1.3.1 稀释液的稀释 将未分解凋落物、半分解凋落物和表层土壤的鲜样用蒸馏水浸泡48 h,过滤。水浸液母液质量体积比例为1∶10,即相当于1 g烘干样加10 m L水。取部分滤液用蒸馏水稀释获得1∶100,1∶200和1∶250比例的稀释液。各比例的浸提液置于冰箱中备用,使用前在0.5 Pa下用高压灭菌锅消毒30 min,放置冷却再用。 1.3.2 液体培养基制备 1.4 种子发芽势、发芽率的测定 将消毒过的柳杉种子置于垫有滤纸的培养皿中,放置种子100粒·皿-1,设3个重复。加入相应提取液5 m L·皿-1,置于培养箱中培养,对照用蒸馏水。培养条件:空气相对湿度为60%,温度23~27℃,无光照。发芽器皿均在105℃条件下消毒2 h。安置发芽的当天为第1天,以后加相应溶液0.5 m L·d-1,以种子周围不出现水膜为宜。第12天统计种子发芽势,第20天统计种子发芽率。以浸提液对种子发芽势和发芽率的影响为标准,衡量浸提液化感强度。 1.5 不同浸提液敏感指数的计算 对各浸提液化感强度进行比较时,其统计假设检验和方差分析均以敏感指数(IR,response index)进行。敏感指数为Williamson提出的衡量化感效应的敏感指数,当IR0时表示浸提液对种子萌发具有促进作用,IR0时表示浸提液对种子萌发有抑制作用。敏感指数的绝对值代表作用强度的大小。计算公式为:IR=1-C/T(T≥C);IR=TC(T≤C)。其中IR为敏感指数,C为对照值,是以蒸馏水培养的种子发芽势或发芽率平均值。T为处理值,是以浸提液培养的种子发芽势或发芽率平均值。 1.6 反相、流动相和检测波长 参照Lodih的方法,并作适当修改,提取、分离凋落物中的酸性组分。测定条件如下。色谱柱:反相symmetry C18柱;流动相:乙腈∶体积分数0.5%乙酸水=43∶57;柱温:室温;流速:1 m L·min-1;检测器:2996型紫外检测器;检测波长:280 nm,进样量10μL。比较样品与标准溶液的保留时间,确定其所含主要化感物质的种类,并计算含量。 1.7 酶提取液的制备 生物测定的前期处理及数据处理方法同1.4节。第20天统计胚根,胚轴长。以培养液对种子胚根长和胚轴长的影响为标准衡量培养液化感强度,数据分析均以IR值进行,具体方法同1.5节。 酶提取液的制备:将发芽种子先用流水冲洗,再用去离子水冲洗,滤纸吸干浮水。称取0.5 g左右置于预冷的研钵中,先加入20 m L预冷的提取介质50 mmol·L-1p H 7.8的磷酸缓冲液(含10.0 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮)充分研磨成匀浆,然后用20 m L提取介质冲洗研钵至50 m L离心管中,于4℃下1万r·min-1离心20 mi